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盐角草钾离子通道蛋白基因SeAKT1的克隆与表达

摘要

盐角草作为一种盐生植物，具有极强的耐盐性。钾离子通道蛋白在维持细胞内外离子平衡中起着关键作用，其中SeAKT1是盐角草中由KAT1/AKT1家族基因演化而来的重要钾离子通道蛋白。本研究旨在克隆盐角草SeAKT1基因，并对其表达模式进行分析。通过对盐角草基因组DNA序列分析，预测出SeAKT1基因位置与长度，利用PCR扩增技术从基因组DNA模板中成功扩增出SeAKT1基因完整序列，经同工酶酶切和DNA测序验证，完成了SeAKT1的克隆。表达分析表明，SeAKT1基因表达受盐胁迫、水胁迫、温度等多种因素调控，盐胁迫是导致其表达上调的主要因素。通过分析启动子区域和转录因子结合位点，预测出多个盐胁迫响应因子与SeAKT1基因的调控关系。本研究为进一步探究盐角草耐盐机理、提高植物耐盐性提供了重要理论依据。

关键词

盐角草；SeAKT1基因；克隆；表达

一、引言

土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的重要问题。盐生植物盐角草能够在高盐环境中生长，其独特的耐盐机制备受关注。钾离子（K+）是植物生长发育所必需的大量元素之一，在维持细胞渗透压、调节气孔运动、酶活性等方面发挥着重要作用。在盐胁迫下，植物维持体内较高的K+/Na+比是其耐盐的重要策略之一，而钾离子通道蛋白在植物对钾离子的吸收和转运过程中起着关键作用。SeAKT1作为盐角草中的钾离子通道蛋白，对其基因的克隆与表达研究有助于深入理解盐角草的耐盐机制，为提高植物耐盐性提供理论基础和基因资源。

二、盐角草SeAKT1基因的克隆及序列分析

2.1盐角草总RNA提取

采集健康的盐角草植株，选取不同组织部位，如根、茎、叶等。采用改良的CTAB法提取盐角草总RNA。具体步骤如下：将组织样品在液氮中迅速研磨成粉末，加入预热的CTAB提取缓冲液，充分混匀后于65℃水浴保温一定时间，期间不时振荡。然后加入氯仿-异戊醇（24:1）混合液，剧烈振荡后离心，取上清液。向上清液中加入异丙醇，低温沉淀RNA，离心后弃上清，用75%乙醇洗涤RNA沉淀，晾干后用适量的DEPC处理水溶解RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白测定仪检测RNA的完整性和浓度，确保提取的RNA质量满足后续实验要求。

2.2盐角草SeAKT1基因部分编码区的获得

根据已报道的植物钾离子通道蛋白基因的保守序列，设计特异性引物AKF和AKR。以提取的盐角草总RNA为模板，按照反转录试剂盒说明书进行反转录反应，得到单链cDNA。以单链cDNA为模板，AKF和AKR为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系包括适量的模板cDNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和缓冲液。PCR扩增程序为：94℃预变性一定时间，然后进行多轮循环，每个循环包括94℃变性、合适温度退火、72℃延伸，最后72℃延伸充分。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带，利用凝胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。将回收产物连接到克隆载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，通过蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定阳性克隆，送测序公司测序。

2.3RLM-RACE法克隆盐角草SeAKT1基因3’cDNA

采用RLM-RACE（RNALigase-MediatedRapidAmplificationofcDNAEnds）技术扩增SeAKT1基因的3’末端。首先，利用烟草酸焦磷酸酶（TAP）去除mRNA5’端的帽子结构，然后连接RNA接头。以连接了接头的mRNA为模板，使用基因特异性引物和接头引物进行两轮PCR扩增。第一轮PCR扩增得到包含3’末端的cDNA片段，将其作为模板进行第二轮巢式PCR扩增，进一步提高扩增的特异性。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收纯化、克隆到载体并测序。对测序结果进行分析，确定SeAKT1基因3’末端的序列。

2.4锚定PCR法克隆SeAKT1基因5’cDNA

对于SeAKT1基因5’末端的克隆，采用锚定PCR法。首先，以总RNA为模板，使用含有oligo(dT)和锚定序列的引物进行反转录反应，合成第一链cDNA。然后，用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）在第一链cDNA的3’末端加上poly(A)尾。以加尾后的cDNA为模板，使用基因特异性引物和锚定引物进行PCR扩增，得到包含5’末端的cDNA片段。同样，对PCR产物进行电泳检测、回收纯化、克隆和测序，从而确定SeAKT1基因5’末端的序列。

2.5SeAKT1基因