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油藏微生物烷烃羟化酶基因的全长克隆及序列分析

摘要：一些油藏微生物能够以原油作为唯一碳源生长，部分微生物在代谢过程中降解原油组分，改变原油流动性，提高残余油采收率。对烷烃单加氧酶基因的研究，可为提高石油采收率、生物修复和生物催化提供理论依据，同时，烷烃降解菌的检测有助于石油勘测及评价环境中石油污染程度。本研究根据相同种属的烷烃单加氧酶基因设计引物，从RhodococcuserythropolisT7-2克隆到四个烷烃单加氧酶基因alkB1、alkB2、alkB3、alkB4，从G.stearothermophilusDM-2克隆到alkB2和alkB3基因，但未得到全长的alkB1和alkB4基因。为获取alkB两翼的全长序列，采用TAIL-PCR方法克隆到DM-2四个完整的alkB基因及其侧翼序列，并对四个alkB基因域、启动子区域、侧翼辅酶等进行详细分析，为后续构建alkB基因的缺失载体奠定基础。功能互补实验证实克隆到的四个基因为具有活性的烷烃单加氧酶基因。蛋白序列分析表明，四个烷烃单加氧酶属于跨膜蛋白，具有AlkB类烷烃单加氧酶保守区域的组氨酸模序。序列分析及同源性比较显示，不同alkB基因存在差异，同属不同种的alkB基因序列相似性较高，通过alkB基因保守区的兼并引物可快速准确检测烷烃降解菌。

一、引言

随着全球对能源需求的不断增长，石油作为重要的能源资源，其开采和利用备受关注。提高石油采收率是当前石油工业面临的重要课题之一。油藏微生物在原油代谢过程中发挥着重要作用，其中烷烃羟化酶基因对于微生物降解原油中的烷烃成分至关重要。研究油藏微生物烷烃羟化酶基因，不仅有助于深入了解微生物提高石油采收率（MEOR）的机制，还可为生物修复石油污染环境以及生物催化领域提供关键的理论支撑。同时，准确检测烷烃降解菌对于石油勘测以及评估环境中石油污染程度具有重要意义。因此，开展油藏微生物烷烃羟化酶基因的全长克隆及序列分析具有重要的理论和实际应用价值。

二、材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株与质粒

实验选用RhodococcuserythropolisT7-2和G.stearothermophilusDM-2作为目标菌株，同时使用PseudomonasfluorescensKOB2A1和E.coliGEc137(pGEc47AB)用于功能互补实验。所用质粒包括用于基因克隆和表达的相关载体。

2.1.2培养基

根据不同菌株的生长需求，配置了相应的培养基，如以原油为唯一碳源的培养基用于筛选和培养烷烃降解菌，LB培养基用于常规细菌培养等。培养基的配方和制备过程严格按照相关标准执行，以确保实验条件的一致性和稳定性。

2.1.3主要试剂与仪器

主要试剂包括各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA连接酶、DNAMarker等，均购自知名生物试剂公司，保证试剂的纯度和活性。实验仪器涵盖PCR扩增仪、凝胶成像系统、离心机、恒温培养箱、核酸测序仪等，仪器设备在实验前均进行了校准和调试，以确保实验数据的准确性和可靠性。

2.2实验方法

2.2.1引物设计

根据已报道的相同种属的烷烃单加氧酶基因序列，利用生物信息学软件进行比对分析，设计特异性引物。引物设计过程中充分考虑引物的长度、GC含量、Tm值以及与模板的特异性结合等因素，确保引物能够准确扩增目标基因片段。引物由专业生物公司合成，并经质量检测合格后使用。

2.2.2基因克隆

采用PCR技术从RhodococcuserythropolisT7-2和G.stearothermophilusDM-2中扩增烷烃单加氧酶基因alkB。PCR反应体系包含模板DNA、引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等，反应条件根据引物和模板的特性进行优化。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，使用胶回收试剂盒回收目的条带，并将其连接到相应的克隆载体上，转化至感受态细胞中进行筛选和鉴定。对于未获得全长的alkB基因，采用TAIL-PCR方法进行基因侧翼序列的扩增。TAIL-PCR反应体系和条件经过多次优化，以提高扩增效率和特异性。通过三轮PCR反应，逐步扩增出基因侧翼的未知序列，最终获得完整的alkB基因及其侧翼序列。将扩增得到的全长基因克隆至合适的表达载体中，构建重组表达质粒。

2.2.3序列测定与分析

将含有目的基因的重组质粒送至专业测序公司进行测序。测序结果使用DNAStar、DNAMAN等生物信息学软件进行分析，包括基因序列的拼接、开放阅读框（ORF）的预测、氨基酸序列的推导等。通过与GenBank数据库中