细胞生物学研究方法：显微技术及其应用.pdfVIP

CH2细胞生物学研究方法

09逸仙尚丽茹

生命科学是实验科学，它的很多成果都是通过实验得以发现和发展起来的。

显微技术是细胞生物学最基本的研究技术，包括光学显微技术和电子显微技术。

显微镜像的形成需要3个基本要素：照明系统、被观察样品、聚焦和成像的透镜系统。

照明系统中，波长决定能被检测样品的最小极限。这也是电镜技术发展的重要依据。

几种常用的光学显微镜包括普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、倒

置显微镜。根据实验目的选择不同的种类。双筒显微镜的优点为同时用两眼观察，有较强的

立体感。荧光显微镜以紫外线为光源照射被检物体，使之发出荧光，可用于研究细胞内物质

的吸收、以及化学物质的分布及定位等。相差显微镜利用光的衍射和特性使相位差

变为振幅差，表现为明与暗的对比。优点是能观察无色、透明、活细胞中的结构，常用于观

察未染色样品。暗视野显微镜利用光的反射和衍射，在暗视野下观察细微粒子。主要观察物

体的轮廓，分辨不清的微细构造。适合观察活细胞内的细胞核、液体介质中的细菌和霉

菌等。光镜样品技术有样品固定、包埋和切片、染色、自显影等。

光学显微镜的分辨率主要是受照明光线的波长限制，这导致了电子显微镜的发明。电子

显微镜是研究亚显微结构的主要工具，透射和扫描电镜书两类主要的电子显微镜。还有在这

两类电子显微镜的基础上发展起来的具有特别功能的电子显微镜，如透射扫描电子显微镜、

免疫电子显微镜、高压电子显微镜等。电子显微镜基本结构由3大部分组成：电子光学系统

（镜筒）、真空系统、电子学系统（供电系统）。用于电子显微镜的组织固定比光镜的要求更

高，样品要求要薄，精细结构需要保持好，样品要有一定的反差。电子显微镜的样品技

术包括负染色、喷镀技术、冷冻断裂复型和冷冻蚀刻等技术。

显微成像包括直接成像和间接成像。光学显微镜和电子显微镜是直接成像的技术，还有

一些显微方法是间接成像，如扫描隧道显微镜，原子力显微镜和X射线衍射。

将细胞形态观察与细胞成分分析结合起来，其中一个重要研究就是细胞化学技术。

细胞化学技术包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、自显影技术、示踪细胞化学技

术等。另外还有显微分光光度术、显微荧光光度术和核磁技术。

流式细胞分选技术是细胞生物学和现物技术中的重要技术，不仅用于分选细胞，还

可分选。细胞分选技术主要用流式细胞仪对细胞或进行分选，并对单个细胞或

其它生物微粒进行定量分析，包括测量细胞大小、形状、细胞、RNA含量和细胞总蛋

白等。细胞分选中用抗体标记细胞，同时被用的抗体被荧光标记，利用荧光检测器来分离细

胞。

细胞工程（cellengineering）技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞

生物学的原理和方法，结合工程学的技术，按人们预先的设计，有计划地改变或创造细

胞遗传性的技术，主要内容包括：细胞融合、细胞生物反应器、转移、细胞器移植、

转移、细胞及组织培养。

分离技术是一大类技术的总称，包括细胞组分的分离和生物大分子的分离。分离技术主

要包括离心分离和层析分离技术。最常用的离心分离细胞组分和大分子的方法是速度离心，

其原理为在一定离心速度下，不同大小的细胞器由于体积不同，沉降速度不同，体积越大沉

降越快。又分为差速离心核仁移动区带离心。根据被分离样品密度可采用等密度离心。层析

（chromatography）是根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的分离方法。各种

层析方法都涉及共同的基本特点：有一个固定相和流动相，当蛋白质混合溶液（流动相）通

过装有珠状或基质材料的管或柱（固定相），由于混合物中各组分理化性质（如、溶

解度、分子形状大小、分子电荷性与亲和力）等方面的差异使各组分在两相间进行反复多次

的分配而得以分开。目前常用的方法有凝胶过滤层析、亲和层析和离子交换层析。

分子生物学方法是在分子水平上物大分子的结构和功能的一系列方法，包括

重组技术、转移、分子杂交、PCR反应、序列分析等。