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基于小IRES与报告基因的新型HCV亚基因复制子细胞系构建及功能探究

一、引言

1.1HCV研究背景与意义

丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus，HCV）是引发丙型肝炎的病原体，这种病毒在全球范围内广泛传播，给人类健康带来了沉重的负担。据世界卫生组织估计，2019年全球约有5800万人感染HCV，每年约有150万新发感染病例，29万人死于HCV感染相关的肝硬化或肝癌。HCV感染具有隐匿性，多数感染者在急性期无明显症状，容易被忽视，从而发展为慢性感染。在慢性感染阶段，病毒持续损伤肝脏，可导致肝脏慢性炎症、坏死和纤维化，部分患者会进一步发展为肝硬化甚至肝细胞癌。

在中国，HCV感染也是一个不容忽视的公共卫生问题。2020年，我国丙肝病毒感染者估计为948.7万人，全国各地抗-HCV阳性率存在一定差异，以长江为界，北方（0.53%）高于南方（0.29%），西北地区丙肝发病率相对较高。目前，HCV感染的治疗主要采用直接作用抗病毒药物（Direct-ActingAntiviralAgents，DAAs），虽然DAAs的出现显著提高了HCV的治愈率，但仍存在一些问题，如耐药性的产生、治疗费用较高等。此外，目前尚无有效的HCV疫苗，这使得预防HCV感染面临巨大挑战。因此，深入研究HCV的生物学特性、致病机制以及开发新的治疗方法和预防策略具有重要的公共卫生意义和医学价值。

1.2HCV亚基因复制子细胞系的研究现状

HCV是一种难以在体外培养和研究的病毒，长期以来限制了对其生物学特性和致病机制的深入了解。1999年，HCV亚基因复制子系统的出现，为HCV研究带来了重大突破，使病毒复制子首次在人源肝癌细胞系中大量复制，成为研究HCV的有效工具。一个亚基因组复制子细胞系通常包含一个含有HCV非结构蛋白基因（NS2-NS5B）和部分或全部结构蛋白基因（C，E1，E2）的表达载体，以及在稳定表达HCV复制所需宿主细胞中的其它HCV因子。

在构建HCV亚基因复制子细胞系的过程中，科学家们不断探索优化方法。常用的方法包括将HCV基因组分割成不同的片段，通过基因引物PCR法扩增后克隆到适当的表达载体中，然后将重组载体转染到合适的宿主细胞系中，如Huh-7细胞系及其衍生细胞系Huh-7.5等。经过G418等药物筛选，获得含有HCV亚基因组复制子的细胞集落，再通过单克隆化培养，筛选出具有稳定遗传和高效复制的细胞单克隆。通过RT-PCR技术、WesternBlot技术以及Real-timePCR等方法，可以验证细胞中HCV亚基因组复制子的存在，并检测其拷贝数和蛋白表达情况。

HCV亚基因复制子细胞系在HCV研究中发挥了重要作用。它被广泛应用于研究HCV的复制机制，通过对复制子中不同基因的功能分析，揭示了HCV复制过程中涉及的关键蛋白和信号通路。在抗病毒药物研发方面，利用HCV亚基因复制子细胞系可以快速筛选和评价药物的抗病毒活性，为新药的开发提供了有效的模型。研究人员可以将不同的药物作用于含有HCV亚基因组复制子的细胞，检测细胞中HCVRNA拷贝数或蛋白表达的变化，从而评估药物对病毒复制的抑制效果。该细胞系还可用于研究HCV与宿主细胞之间的相互作用，探索宿主细胞因子对病毒复制的影响，以及病毒感染对宿主细胞生理功能的改变。

然而，现有的HCV亚基因复制子细胞系仍存在一些问题和局限性。部分复制子细胞系的复制效率较低，影响了研究的准确性和效率。在药物筛选过程中，由于细胞系本身的特性，可能会出现假阳性或假阴性结果，导致对药物疗效的误判。现有的复制子细胞系在模拟HCV在体内的感染和致病过程方面还存在一定差距，无法完全反映病毒在真实生理环境下的行为。

1.3构建新型HCV亚基因复制子细胞系的目的和创新点

为了克服现有HCV亚基因复制子细胞系的不足，本研究旨在构建一种含有小IRES（内部核糖体进入位点）和报告基因的新型HCV亚基因复制子细胞系。小IRES是一种翻译控制元件，能够增加HCV非结构蛋白基因的翻译效率，从而提高HCV复制子的产量。已有研究表明，小IRES可以有效地促进各种病毒基因的翻译，包括HCV的翻译。将小IRES添加到HCV亚基因组复制子中，有望提高病毒蛋白的表达水平，增强复制子的复制能力，为研究提供更丰富的实验材料。

报告基因的添加是本研究的另一个关键创新点。报告基因是一种可以用来检测病毒复制子在细胞中表达的蛋白质的基因。通过将报告基因整合到HCV亚基因组复制子中，可以直观、快速地