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番茄SlBLI2基因VIGS载体的构建及其功能研究

一、番茄SlBLI2基因VIGS载体的构建

1.1.SlBLI2基因的克隆与鉴定

(1)为了研究番茄SlBLI2基因的功能，我们首先从番茄基因组中克隆了该基因的全长序列。通过PCR扩增，我们从番茄基因组DNA中成功获得了SlBLI2基因的编码区，该区域全长约1500碱基。随后，我们利用T-A克隆技术将SlBLI2基因克隆到pMD18-T载体中，并通过测序验证了克隆片段的准确性。进一步地，为了确保克隆的基因序列与目标基因完全一致，我们进行了BLAST比对分析，结果显示SlBLI2基因的核苷酸序列与已知的番茄SlBLI2基因序列高度同源，同源性达到99%以上。

(2)在获得SlBLI2基因克隆后，我们对其进行了表达分析。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，我们检测了SlBLI2基因在番茄不同生长发育阶段的表达水平。结果显示，SlBLI2基因在番茄幼苗期、开花期和果实成熟期均有表达，其中在果实成熟期表达量最高。此外，我们还分析了SlBLI2基因在番茄不同组织中的表达模式，发现其在叶片、茎和果实中均有表达，而在根部表达量相对较低。这些数据表明SlBLI2基因在番茄的生长发育过程中发挥重要作用。

(3)为了进一步验证SlBLI2基因的功能，我们构建了SlBLI2基因的RNA干扰载体。通过设计特异性siRNA序列，我们成功构建了pTRV2-SlBLI2-siRNA载体。在转化实验中，我们利用农杆菌介导法将载体转入番茄叶片，并成功实现了SlBLI2基因的沉默。通过qRT-PCR检测，我们发现SlBLI2基因的表达量在转基因番茄中显著降低，说明我们的RNA干扰载体能够有效抑制SlBLI2基因的表达。此外，我们还通过Westernblotting技术检测了SlBLI2蛋白的表达水平，结果显示在转基因番茄中SlBLI2蛋白的表达量也显著降低，进一步证实了我们的RNA干扰载体的有效性。

2.2.VIGS载体的设计

(1)VIGS载体的设计首先需确定目标基因的siRNA序列。通过对SlBLI2基因序列进行比对分析，我们选取了两个特异性强、GC含量适宜的siRNA序列。这两个siRNA序列分别为：5-GCTAGCACTCGACACGGAAT-3和5-GGCCATGCCGATGGAGTGTGA-3。为确保siRNA序列的特异性，我们利用在线软件进行靶标分析，确保其不与番茄基因组中的其他基因序列同源。

(2)在设计VIGS载体时，我们选择了双元载体pTRV2作为基础载体。pTRV2载体具有病毒来源的复制原点（rep）和启动子（Ri），能够确保siRNA在植物细胞中的高效复制和表达。我们通过酶切和连接技术将上述siRNA序列克隆到pTRV2载体中，得到pTRV2-SlBLI2-siRNA载体。为增强载体的转染效率，我们在siRNA序列两侧引入了T7启动子和终止子，以利于农杆菌介导的基因转化。

(3)在构建VIGS载体过程中，我们还考虑了载体的稳定性。为此，我们在载体中引入了绿色荧光蛋白（GFP）基因作为报告基因，便于实时观察载体的转化效果。此外，我们还对载体进行了序列验证，确保其结构完整，无突变发生。通过上述设计，我们成功构建了pTRV2-SlBLI2-siRNA载体，为后续的SlBLI2基因功能研究奠定了基础。

3.3.载体构建与序列验证

(1)载体构建是VIGS技术研究中的关键步骤，我们首先对pTRV2载体进行了改造，以适应SlBLI2基因的siRNA插入。我们利用限制性内切酶BamHI和HindIII对pTRV2载体进行双酶切，释放出载体骨架。随后，通过PCR扩增SlBLI2基因的siRNA序列，并利用T4连接酶将扩增的siRNA片段与酶切后的载体骨架连接。连接产物经过琼脂糖凝胶电泳鉴定后，成功构建了含有siRNA序列的pTRV2-SlBLI2-siRNA载体。

(2)为了确保构建的VIGS载体的正确性和功能，我们对其进行了序列验证。首先，我们使用T7和T3引物对载体进行PCR扩增，以检测siRNA序列是否正确插入。通过琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物，确认了预期大小的siRNA片段。接着，我们对PCR产物进行测序，将测序结果与预期的siRNA序列进行比对，确认没有引入任何突变。此外，我们还对载体的其他基因片段，如Ri启动子和rep复制原点，进行了序列验证，确保其序列完整无缺。

(3)在完成序列验证后，我们进一步对构建的pTRV2-SlBLI2-siRNA载体进行了生物学功能验证。我们利用农杆菌介导法将载体转入番茄叶片，并观察转化效率。通过荧光显微镜观察GFP表达情况，发现大部分转基因叶片均呈现绿色荧光，表明载体已成功转化至番茄细胞