解鸟氨酸拉乌尔菌ZK4菊酯农药降解酶基因BioH的克隆及原核表达.docxVIP

研究报告

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解鸟氨酸拉乌尔菌ZK4菊酯农药降解酶基因BioH的克隆及原核表达

一、实验材料与方法

1.实验材料

(1)实验材料主要包括鸟氨酸拉乌尔菌ZK4菌株、大肠杆菌DH5α菌株、质粒pET-28a（+）等。鸟氨酸拉乌尔菌ZK4菌株为我国科学家从土壤中分离得到的具有降解菊酯农药能力的细菌，其降解酶BioH具有高效的降解活性。大肠杆菌DH5α菌株为常用的重组DNA宿主菌，具有良好的生长性能和重组能力。质粒pET-28a（+）是一种表达载体，其含有T7启动子、核糖体结合位点、多克隆位点和抗氨苄青霉素基因等，适用于表达外源蛋白。

(2)实验试剂包括PCR试剂盒、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、蛋白纯化试剂盒、蛋白浓度测定试剂盒、酶标仪、紫外分光光度计、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、培养箱、冰箱等。PCR试剂盒包含PCR反应试剂、缓冲液、DNA聚合酶等，用于扩增目的基因；限制性内切酶用于切割目的基因和载体；DNA连接酶用于连接目的基因和载体；DNA聚合酶用于扩增目的基因；质粒提取试剂盒用于提取质粒；凝胶回收试剂盒用于回收PCR产物；蛋白纯化试剂盒用于纯化表达蛋白；蛋白浓度测定试剂盒用于测定蛋白浓度；酶标仪、紫外分光光度计、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等用于实验操作和结果分析；离心机、移液器、培养箱、冰箱等用于实验过程中的常规操作。

(3)实验仪器包括超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、培养箱、冰箱、超低温冰箱、振荡器、恒温水浴锅、生物安全柜、显微镜、显微镜载物台、显微镜目镜、显微镜物镜、显微镜照明系统、电子天平、移液枪、移液管、锥形瓶、试管、培养皿、滤纸、酒精灯、火柴、镊子、剪刀、手术刀、解剖针、移液针、移液枪头、PCR管、电泳槽、电泳凝胶、电泳缓冲液、凝胶成像系统等。超净工作台用于实验操作过程中的无菌操作；PCR仪用于PCR扩增；电泳仪用于电泳分离；凝胶成像系统用于观察和记录电泳结果；离心机用于分离、纯化蛋白和DNA；移液器、移液枪、移液管、锥形瓶、试管、培养皿等用于实验操作；滤纸、酒精灯、火柴、镊子、剪刀、手术刀、解剖针、移液针、移液枪头等用于实验操作；PCR管、电泳槽、电泳凝胶、电泳缓冲液等用于电泳操作；凝胶成像系统用于观察和记录电泳结果；电子天平用于称量试剂和样品；振荡器用于混合试剂和培养菌种；恒温水浴锅用于加热试剂和培养菌种；生物安全柜用于实验操作过程中的生物安全防护；显微镜、显微镜载物台、显微镜目镜、显微镜物镜、显微镜照明系统等用于观察和记录显微结构。

2.实验试剂

(1)实验试剂主要包括PCR试剂盒、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、蛋白纯化试剂盒、蛋白浓度测定试剂盒等。PCR试剂盒含有PCR反应试剂，包括缓冲液、DNA聚合酶、引物等，适用于目的基因的扩增。限制性内切酶用于切割目的基因和载体，常用的酶有EcoRI、BamHI等。DNA连接酶用于连接目的基因和载体，常用的酶有T4DNA连接酶。DNA聚合酶用于扩增目的基因，如KOD聚合酶、Taq聚合酶等。质粒提取试剂盒用于提取质粒，包括裂解液、洗涤液、溶解液等。凝胶回收试剂盒用于回收PCR产物，包括胶回收试剂盒和DNA纯化试剂盒。蛋白纯化试剂盒用于纯化表达蛋白，包括亲和层析柱、离子交换层析柱等。蛋白浓度测定试剂盒用于测定蛋白浓度，如BCA蛋白浓度测定试剂盒。

(2)实验中还使用了多种缓冲液和试剂，如Tris-HCl缓冲液、NaCl溶液、EDTA溶液、SDS溶液、甘氨酸溶液、丙烯酰胺溶液、甲叉双丙烯酰胺溶液等。Tris-HCl缓冲液用于调节pH值，保持实验体系的稳定。NaCl溶液用于维持细胞渗透压和电导率。EDTA溶液用于螯合金属离子，防止DNA酶和RNA酶的活性。SDS溶液用于蛋白质变性，便于电泳分离。甘氨酸溶液用于电泳缓冲液，提高电泳迁移率。丙烯酰胺溶液和甲叉双丙烯酰胺溶液用于制备聚丙烯酰胺凝胶，进行蛋白质电泳。

(3)此外，实验中还使用了多种有机溶剂和无机盐，如无水乙醇、异丙醇、氯仿、异戊醇、氨水、氢氧化钠、硫酸铵等。无水乙醇和异丙醇用于沉淀DNA和蛋白质。氯仿和异戊醇用于提取质粒。氨水和氢氧化钠用于调节pH值。硫酸铵用于蛋白质沉淀和纯化。这些试剂在实验中发挥着重要作用，确保实验结果的准确性和可靠性。

3.实验仪器

(1)实验中使用的仪器包括超净工作台，其具有高效的空气过滤系统，能够有效减少实验室空气中的微生物和尘埃，确保实验的无菌操作。例如，在构建重组表达载体时，超净工作台的使用可以降低污染风险，保证实验结果的准确性。超净工作台的洁净度通常可以达到100级，适用于高精度的分子生物学实验。