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研究报告

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一种酿酒酵母组成型分泌表达载体的构建及应用

一、1.组成型分泌表达载体的构建

1.1载体选择与设计

在构建组成型分泌表达载体时，载体的选择与设计至关重要。首先，载体需具备较高的复制能力，以确保在宿主细胞中稳定存在并高效表达。常用的载体包括质粒和噬菌体载体。质粒载体因其易于操作、复制速度快等特点，在酵母表达系统中应用广泛。例如，pPIC9K质粒是酵母表达系统中常用的克隆载体，其携带的Ampr基因可用于筛选转化子。此外，质粒载体还需具备适当的启动子和终止子，以便于目的基因的转录和翻译。

其次，选择合适的启动子对于提高目的基因的表达水平至关重要。在酿酒酵母中，常用的启动子包括ADH1、GAP、PGK等。ADH1启动子来源于酒精脱氢酶基因，具有组成型活性，在酵母中表达效率较高。研究表明，使用ADH1启动子可以使目的蛋白的表达水平提高数倍。例如，在一项研究中，通过ADH1启动子表达人干扰素α2b，其表达水平达到了1mg/L，远高于其他启动子。

最后，载体的设计还需考虑目的基因的插入位点。目的基因的插入位置会影响其表达效率和蛋白质的分泌。通常，将目的基因插入到酵母细胞的分泌途径中，如HSP90、ERG20等信号肽基因下游，可以促进蛋白质的分泌。例如，在一项研究中，通过将人免疫球蛋白G1的重链基因插入到HSP90基因下游，成功实现了蛋白质的分泌表达。此外，载体设计时还需考虑插入片段的大小，通常不超过2kb，以确保基因的稳定插入和表达。

1.2启动子和终止子的选择

(1)在选择启动子时，需考虑其转录活性和调控特性。酿酒酵母中，ADH1、GAPDH和PGK1等启动子因其组成型活性而受到青睐。例如，ADH1启动子来源于酒精脱氢酶基因，在酵母中几乎恒定表达，其转录活性约为每分钟1000个核苷酸。在一项研究中，使用ADH1启动子表达人干扰素α2b，结果显示表达水平达到1mg/L，显著高于其他启动子。

(2)对于需要精确调控表达的基因，应选择受特定条件调控的启动子。例如，Gal4启动子可以响应galactose的存在，而Tet-on系统则受tetracycline类药物调控。在一项关于Tet-on系统的应用研究中，通过添加tetracycline诱导表达，成功实现了目的基因的精确调控。此外，Tet-on系统在基因治疗和细胞工程领域具有广泛应用前景。

(3)终止子的选择同样重要，它影响着转录的结束。在酿酒酵母中，T7终止子因其转录效率高而常被选用。在一项研究中，使用T7终止子构建表达载体，结果显示目的基因的表达水平提高了约30%。此外，终止子的选择还需考虑其与启动子的兼容性，以确保转录过程的顺利进行。例如，ADH1启动子与T7终止子组合使用，在酵母中表现出良好的表达性能。

1.3目的基因的克隆与插入

(1)目的基因的克隆与插入是构建分泌表达载体的关键步骤。首先，需要通过PCR技术扩增目的基因。在扩增过程中，需设计特异性引物，确保目的基因的准确性和完整性。例如，在表达人干扰素α2b的研究中，利用引物设计软件生成了针对人干扰素α2b基因的两个引物，扩增出长度为1200bp的基因片段。

接着，将扩增得到的目的基因片段插入到载体中。这一步骤通常涉及酶切和连接反应。常用的酶有EcoRI、BamHI和HindIII等，它们具有识别特定序列并切割DNA的能力。在上述干扰素α2b表达研究中，选择了EcoRI和HindIII进行酶切，成功地将目的基因片段插入到pPIC9K质粒载体中。

(2)为了确保目的基因在宿主细胞中能够稳定表达并正确分泌，还需要考虑序列的兼容性。序列兼容性包括起始密码子、终止密码子、Kozak序列以及内含子等。例如，在构建人干扰素α2b表达载体时，将起始密码子ATG替换为酿酒酵母的起始密码子GTA，提高了蛋白的正确折叠和分泌。此外，还添加了酿酒酵母的终止密码子TAA，以减少假终止子的形成。

为了进一步验证目的基因的正确插入，可进行一系列的检测，包括DNA序列分析、酶切鉴定、PCR扩增以及测序等。例如，在干扰素α2b表达载体构建过程中，对插入片段进行了两次DNA测序，确保目的基因序列的准确性。同时，通过酶切反应，验证了质粒载体上两个酶切位点的正确酶切，确保目的基因正确插入。

(3)在构建分泌表达载体时，还需考虑载体拷贝数对表达水平的影响。通常，通过改变载体拷贝数可以调节目的基因的表达量。在一项研究中，构建了拷贝数为单拷贝、双拷贝和三拷贝的pPIC9K载体，分别转化到酿酒酵母中。结果显示，单拷贝载体的表达水平约为2mg/L，而双拷贝和三拷贝载体的表达水平分别达到3.5mg/L和4.5mg/L，说明载体拷贝数的增加能够显著提高目的基因的表达水平。

为了进一步优化表达系统，还可在载体中加入诱导剂响