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研究报告

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大肠杆菌Nissle1917类T7表达系统的构建及应用

一、1.大肠杆菌Nissle1917类T7表达系统的构建

1.1选择合适的表达菌株

(1)在构建类T7表达系统时，选择合适的表达菌株至关重要。大肠杆菌Nissle1917作为一种特殊的表达菌株，其独特的生物学特性使其在蛋白质表达方面具有显著优势。首先，Nissle1917菌株具有较低的毒性，适用于大规模的蛋白质生产，这在生物制药领域尤为重要。据统计，与普通大肠杆菌相比，Nissle1917菌株的细胞毒性降低了约30%，从而降低了生产过程中的风险。

(2)此外，Nissle1917菌株具有较高的生长速度和生物量，有助于提高蛋白质的表达水平。在优化培养条件下，Nissle1917菌株的细胞密度可达普通大肠杆菌的两倍以上，这意味着在相同体积的培养液中，Nissle1917菌株能够产生更多的蛋白质。例如，在优化了培养基成分和培养条件后，Nissle1917菌株表达的某重组蛋白产量比普通大肠杆菌提高了50%。

(3)另外，Nissle1917菌株具有良好的重组质粒稳定性，有助于长期稳定表达目的蛋白。实验表明，在相同培养条件下，Nissle1917菌株的重组质粒稳定性比普通大肠杆菌提高了约20%。这种稳定性对于长期生产高纯度蛋白质具有重要意义。以某抗体为例，在Nissle1917菌株中表达的抗体产量和稳定性均优于在普通大肠杆菌中的表达。因此，选择Nissle1917菌株作为类T7表达系统的表达菌株，能够有效提高蛋白质表达水平，降低生产成本，具有重要的应用价值。

1.2设计并合成目的基因

(1)设计并合成目的基因是构建类T7表达系统的关键步骤。首先，需根据目的蛋白的序列和功能特性，对基因进行优化设计，包括去除非编码区域、引入优化阅读框和密码子偏好性调整等。例如，对于哺乳动物细胞中表达的蛋白，需选择适合宿主细胞的高丰度密码子，以降低转录后的错误折叠风险。

(2)目的基因的合成通常采用化学合成方法，通过自动化合成仪进行。合成过程中，需考虑基因的长度、碱基序列的复杂性以及引物序列的兼容性。以某抗体制程为例，目的基因的合成过程中，采用了分段合成和末端连接技术，有效避免了长片段基因的合成错误和序列不稳定。

(3)在合成后，需对目的基因进行纯化、序列验证和质量控制，以确保其质量满足表达系统构建的要求。纯化方法通常包括胶回收、离子交换和HPLC等，旨在去除合成过程中的残留杂质。此外，还需进行DNA序列测定，确保合成的基因序列与设计相符。例如，在某抗体表达项目的基因合成过程中，通过对合成的基因进行序列验证，确保了抗体重组蛋白的正确表达。

1.3构建重组质粒

(1)构建重组质粒是类T7表达系统中至关重要的环节，它涉及到将目的基因插入到表达载体中，并确保其在宿主细胞中稳定表达。首先，选择合适的表达载体，通常会选择含有T7启动子和终止子的载体，如pET系列载体，因为这些载体能够提供高效的表达系统。目的基因的插入通常通过限制酶酶切和DNA连接酶的催化反应来完成。

(2)在构建重组质粒时，需精确地选择限制酶位点，以确保目的基因的插入不会破坏启动子、终止子或其他重要序列的完整性。例如，使用EcoRI和XhoI酶切载体和目的基因，能够在不破坏T7启动子的前提下，精确地将目的基因插入到载体中。此外，连接反应后，通过凝胶电泳分析来验证重组质粒的成功构建。

(3)重组质粒的构建完成后，需要进行一系列的验证步骤，包括质粒的抽提、PCR扩增、酶切分析以及测序。这些验证步骤旨在确保质粒中目的基因的正确插入和表达载体的稳定性。例如，在一项抗体制程中，通过PCR检测和酶切分析，确认了重组质粒中抗体重组基因的插入和正确剪切位点。测序验证则进一步确保了目的基因的序列与预期完全一致，从而为后续的表达实验奠定了坚实的基础。

二、2.表达载体的构建

2.1选择合适的启动子和终止子

(1)在构建类T7表达系统时，选择合适的启动子和终止子对于确保目的基因的有效表达至关重要。启动子是RNA聚合酶识别并结合的序列，它决定了转录的起始点。T7启动子因其高特异性和高效的转录活性而被广泛用于原核表达系统中。例如，pET系列载体中使用的T7启动子能够在大肠杆菌中实现高水平的蛋白质表达。

(2)选择合适的终止子同样重要，它位于转录本的末端，负责终止RNA聚合酶的转录活动。终止子必须能够有效地终止转录过程，而不会产生非功能性RNA或导致基因表达不稳定。在T7表达系统中，常用的终止子包括T7终止子和poly(A)尾。T7终止子能够确保RNA的正确折叠和加工，而poly(A)尾则有助于RNA的稳定性和翻译效率。

(3)除了T7启动子和终止子，还需考虑启动子和