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银杏雌雄花芽差异表达基因研究

摘要

银杏作为典型的雌雄异株裸子植物，其性别决定机制一直是研究热点。本研究利用RNA-Seq技术对银杏雌雄花芽进行转录组测序及生物信息学分析，旨在挖掘与性别决定相关的差异表达基因。通过对测序数据的深入分析，鉴定出一系列在雌雄花芽中差异表达的基因，这些基因涉及植物激素信号转导、DNA甲基化等多个重要生物学过程。研究结果为全面理解银杏性别决定机制奠定了基础，也为银杏的早期性别鉴定及遗传改良提供了理论依据。

关键词

银杏；雌雄花芽；差异表达基因；性别决定

一、引言

银杏（GinkgobilobaL.）是一种古老的裸子植物，具有极高的经济价值和生态价值。其在观赏、药用、木材等领域均有广泛应用。银杏为雌雄异株植物，雌雄株在生长习性、形态特征与生产应用等方面存在显著差异。例如，雌株会结果，而雄株则不结果，且雄株的生长速度可能相对较快等。在实际生产和应用中，早期准确鉴定银杏性别具有重要意义，然而，由于银杏童期较长，传统的基于形态特征的性别鉴定方法往往需要多年才能确定，这极大地限制了银杏的高效利用和品种选育。因此，深入研究银杏的性别决定机制，寻找早期性别鉴定的分子标记，对于银杏产业的发展至关重要。植物的性别决定是一个复杂的过程，涉及到众多基因的差异表达和相互作用。近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，转录组测序技术（RNA-Seq）已成为研究植物性别决定机制的重要手段。通过对银杏雌雄花芽进行转录组测序，可以全面了解在性别决定关键时期基因的表达情况，筛选出与性别决定相关的差异表达基因，进而深入探究银杏的性别决定机制。

二、材料与方法

2.1实验材料

选取来自同一家系的25年生银杏雌株和雄株作为实验材料。在花芽分化的关键时期，分别采集雌株和雄株的花芽。为确保实验的准确性和可靠性，每个样本设置3个生物学重复。采集后的花芽迅速放入液氮中冷冻，并保存于-80℃冰箱备用。

2.2RNA提取与文库构建

采用改良的CTAB法提取银杏雌雄花芽的总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop分光光度计检测RNA的质量和浓度，确保RNA的完整性和纯度符合要求。以总RNA为模板，利用Oligo(dT)磁珠富集mRNA，然后将mRNA随机打断成短片段。以短片段mRNA为模板，反转录合成cDNA第一链，再合成cDNA第二链。对合成的cDNA进行末端修复、加A尾、连接测序接头等一系列处理后，进行PCR扩增，构建cDNA文库。

2.3转录组测序

将构建好的cDNA文库在IlluminaHiSeq平台上进行高通量测序。测序过程中，采用双端测序（Paired-End）模式，每个文库的测序数据量不低于6Gb。测序完成后，对原始数据进行质量控制，去除低质量的reads和接头序列，得到高质量的cleanreads。

2.4数据分析

利用Trinity软件对cleanreads进行denovo组装，得到unigenes。将组装得到的unigenes与多个公共数据库（如NR、Swiss-Prot、KEGG、GO等）进行比对，进行功能注释和分类。通过DESeq2软件分析雌雄花芽之间的差异表达基因，设定筛选标准为|log2(FoldChange)|≥1且FDR＜0.05。对差异表达基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，以了解这些基因参与的生物学过程和信号通路。

2.5实时荧光定量PCR验证

为验证转录组测序结果的可靠性，随机挑选26个差异表达基因进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证。根据基因序列设计特异性引物，以银杏Actin基因作为内参基因。采用SYBRGreen染料法进行qRT-PCR反应，反应体系和程序按照试剂盒说明书进行。每个样品设置3个技术重复，通过2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量，并与转录组测序结果进行相关性分析。

三、结果与分析

3.1转录组测序数据统计

通过对8个cDNA文库（雌雄花芽各3个重复）的测序，共得到大约60Gb的高质量cleanreads。将cleanreads进行denovo组装，共得到108,307条unigenes，平均长度为796bp。对unigenes进行功能注释，其中51,953条（47.97%）在公共数据库中至少有一个显著匹配的基因序列。

3.2差异表达基因分析

差异表达分析结果表明，在雄花芽（MB）与雌花芽（FB）的比较组中，共鉴定出4709个差异表达基因，其中上调表达的基因有2356个，下调表达的基因有2353个。