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自由基清除DPPH实验教学方案

一、教学目标

本实验旨在使学生掌握DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）法测定样品自由基清除能力的基本原理和操作技能。通过实验，学生应能理解抗氧化剂清除自由基的化学机制，熟悉分光光度计的使用，学会实验数据的记录、处理与结果分析，并能对样品的抗氧化活性做出初步评价。同时，培养学生严谨的科学态度、规范的实验操作习惯以及分析问题和解决问题的能力。

二、适用对象与学时

本方案适用于高等院校生物化学、食品科学、药学、营养学等相关专业的本科生或研究生实验教学。建议学时为3-4学时（可根据实际教学进度和学生操作熟练程度适当调整）。

三、实验原理

DPPH是一种稳定的有机氮自由基，在有机溶剂中呈现深紫色，其乙醇或甲醇溶液在特定波长（通常为517nm）下有最大吸收峰。当DPPH溶液中加入具有自由基清除能力的抗氧化剂时，抗氧化剂分子提供的氢原子或电子能够与DPPH自由基结合，使其配对形成稳定的DPPH-H分子，从而导致溶液的颜色由深紫色逐渐变浅，在517nm处的吸光度值随之降低。

通过测定反应前后溶液吸光度的变化，可以计算出样品对DPPH自由基的清除率。清除率的高低反映了样品抗氧化活性的强弱。通常以清除率达到50%时所需样品的浓度（IC50）来表示样品抗氧化能力的大小，IC50值越小，表明样品的抗氧化活性越强。

清除率计算公式如下：

清除率(%)=[1-(A样品-A样品空白)/A对照]×100%

其中：

*A对照：DPPH溶液与溶剂（无抗氧化剂）反应后的吸光度。

*A样品：DPPH溶液与样品溶液反应后的吸光度。

*A样品空白：样品溶液与溶剂（无DPPH）反应后的吸光度（用于消除样品自身颜色对测定的干扰）。

四、实验材料与试剂

1.样品：根据教学需求选择，如植物提取物、抗氧化剂标准品（如维生素C、Trolox等）、食品或饮料样品等。样品需提前进行适当处理，如溶解、稀释、离心、过滤等，确保其为澄清溶液。

2.主要试剂：

*DPPH（纯度≥95%）

*无水乙醇（分析纯）或甲醇（分析纯）

*维生素C（VC）或Trolox（作为阳性对照，可选）

*磷酸缓冲液（PBS，可选，用于维持特定pH环境）

*其他辅助试剂（根据样品特性选择）

3.试剂配制：

*DPPH溶液：精确称取一定量的DPPH，用无水乙醇或甲醇溶解并定容，配制成浓度为0.1mmol/L左右的溶液。该溶液需避光冷藏保存，且最好现用现配或在一周内使用，并在使用前恢复至室温。

*样品溶液：将处理好的样品用溶剂（与配制DPPH相同的溶剂或特定缓冲液）溶解并稀释成一系列不同浓度的溶液，或单一浓度进行初步筛选。

*阳性对照溶液：如VC溶液，用溶剂配制成已知浓度的溶液。

五、实验仪器与设备

1.可见分光光度计或紫外-可见分光光度计

2.分析天平（精度0.1mg）

3.移液器（1mL,2mL,5mL等，配套吸头）

4.容量瓶（10mL,25mL,50mL,100mL等）

5.烧杯、试管、试管架、移液管

6.涡旋混合器

7.恒温水浴锅或培养箱（可选，用于控制反应温度）

8.离心机（可选，用于样品预处理）

9.超声清洗仪（可选，用于样品溶解）

10.冰箱（用于试剂保存）

11.计时器

12.滤纸、漏斗等

六、实验方法与步骤

1.准备工作：

*检查所需仪器是否正常工作，分光光度计预热并校准。

*准备好所有试剂，将冷藏试剂恢复至室温。

*按要求配制DPPH溶液、系列浓度的样品溶液、阳性对照溶液（若使用）。

*标记好试管或比色管，做好实验记录准备。

2.样品自由基清除率的测定：

*空白对照组（Blank）：在试管中加入2.0mLDPPH溶液和2.0mL溶剂（如乙醇）。（具体体积可根据比色皿大小调整，保持DPPH与样品/溶剂的比例一致）

*样品组：在试管中加入2.0mLDPPH溶液和2.0mL不同浓度的样品溶液。

*样品空白组（SampleBlank）：在试管中加入2.0mL溶剂（如乙醇）和2.0mL相应浓度的样品溶液。（用于扣除样品自身颜色的干扰）

*阳性对照组（PositiveControl,若使用）：在试管中加入2.0mLDPPH溶液和2.0mL阳性对照溶液（如VC溶液）。

*阳性对照空白组（若使用）：在试管中加入2.0mL溶剂和2.0mL阳性对照溶液。

3.反应与测定：

*将上述各管溶液迅速混匀（可涡旋混合）。

*置于避光处（如暗盒或铝箔纸包裹）室温反应30分钟（或根据预实验确定的最佳反应时间，如20-60分钟）。

*反应结束后，立即使用