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微生物限度检查法操作规程

微生物限度检查法是药品、食品及化妆品等领域评估产品微生物污染状况的核心技术手段，通过定量检测样品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数以及定性检查控制菌的存在情况，确保产品符合微生物质量标准。该方法依据《中国药典》四部通则1105、1106及1107的相关规定执行，适用于各类非无菌制剂及其原辅料的微生物污染程度评价。

一、实验环境设施与人员要求

①洁净区域分级管理。微生物限度检查应在不低于D级背景的生物安全柜或超净工作台中进行，操作区洁净度需达到万级标准（空气中≥0.5微米悬浮粒子最大允许数为352000个每立方米）。实验室应设置独立的人流、物流通道，配备缓冲间与更衣室，避免交叉污染。环境监控频率为每周一次，包括沉降菌检测（Φ90毫米平皿暴露30分钟）与浮游菌采样（采样量1000升），沉降菌限度不得超过100菌落形成单位每皿。

②关键设备配置标准。生物安全柜气流流速应维持在0.3-0.5米每秒，每年由专业机构进行性能验证。培养箱温度精度需控制在±1摄氏度范围内，使用经过校准的铂电阻温度计进行监测，每日记录两次。高压蒸汽灭菌器灭菌程序应达到121摄氏度、15分钟标准，每批次采用化学指示胶带与生物指示剂（嗜热脂肪芽孢杆菌孢子）双重验证。薄膜过滤装置需配备直径50毫米、孔径0.45微米的滤膜，材质根据样品特性选择混合纤维素酯或聚偏氟乙烯。

③人员资质与操作规范。操作人员需具备微生物学相关专业背景，经过不少于40小时的岗前培训，涵盖无菌技术、消毒灭菌、生物安全等内容。进入洁净区前应更换专用工作服，佩戴无粉乳胶手套与一次性口罩，手部使用75%乙醇溶液消毒30秒。操作过程中动作幅度应控制在最小范围，避免在生物安全柜内频繁进出物品，减少气流扰动。

二、培养基与试剂质量控制

①培养基制备与储存。胰酪大豆胨液体培养基（TSB）与胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）用于需氧菌总数测定，配制时胰酪胨用量为17克每升，大豆木瓜蛋白酶消化物3克每升，氯化钠5克每升，磷酸氢二钾2.5克每升，葡萄糖2.5克每升，pH值调节至7.3±0.2。沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）用于霉菌酵母菌计数，葡萄糖含量40克每升，pH值5.6±0.2。制备后培养基应在2-8摄氏度避光保存，液体培养基使用期限为21天，琼脂培养基为42天。

②适用性试验验证。每批次培养基使用前必须进行促生长能力测试，接种试验菌液（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉）浓度控制在每毫升100菌落形成单位以下，培养后菌落数与对照培养基相比应在50%-200%范围内。同时开展无菌性检查，每批次取不少于5支（瓶）未开封培养基，在20-25摄氏度培养14天，不得有菌生长。

③试剂纯度要求。稀释液采用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，蛋白胨含量为1克每升，氯化钠8.5克每升，pH值7.0-7.2，灭菌后储存期不超过30天。中和剂如聚山梨酯80使用浓度为1%（毫升每毫升），用于含防腐剂样品的处理。所有化学试剂应为分析纯级别，水应符合纯化水标准（电导率≤5.1微西门子每厘米）。

三、样品前处理与供试液制备

①样品接收与状态评估。接收样品时核对品名、批号、规格与检验申请单一致性，检查包装完整性。固体样品取样量不少于10克，液体样品不少于10毫升。样品应在2-8摄氏度条件下保存，检验自接收之日起不得超过24小时。对于特殊剂型，软膏剂需称取5克，乳膏剂10克，栓剂10枚，膜剂10片，确保取样代表性。

②常规供试液制备方法。水溶性样品直接加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，制成1:10供试液（10克样品加100毫升稀释液）。非水溶性样品采用聚山梨酯80作为乳化剂，称取10克样品，加入5克聚山梨酯80，充分研磨后缓慢加入85毫升稀释液，制成1:10供试液。制备过程使用均质器，转速8000转每分钟，处理时间1-2分钟，温度控制在40摄氏度以下，避免过热导致微生物死亡。

③特殊样品处理技术。抑菌性样品需采用薄膜过滤法，冲洗液用量不少于500毫升，分3-5次冲洗，每次100毫升，充分去除残留抑菌成分。油溶性样品如薄荷油，使用十四烷酸异丙酯作为溶剂，样品与溶剂比例为1:10，涡旋混合5分钟，使微生物充分释放。纳米制剂需超声处理，功率300瓦，频率40千赫兹，时间3分钟，超声过程采用冰浴降温。

四、微生物计数法操作流程

①平皿倾注法标准步骤。取1:10供试液1毫升，注入直径90毫米无菌平皿中，倾注15-20毫升温度不超过45摄氏度的熔融TSA培养基，顺时针旋转平皿3-5次使混合均匀。待琼脂凝固后，倒置放入培养箱。需氧菌总数在30-35摄氏度培养3-5天，霉菌酵母菌总数在20-25摄氏度培养5-7天。每稀释级至少制备2个平皿，同时设置阴性对照（稀释液1毫升替代供试液）。

②薄膜过滤法精确计数。将1