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Transwell细胞迁移实验步骤详解

Transwell细胞迁移实验是研究细胞运动能力的经典方法，其核心在于利用一种带有通透性膜的小室，观察细胞在特定条件下穿越该膜的能力，从而反映细胞的迁移活性。该技术广泛应用于肿瘤侵袭转移、炎症反应、血管新生等多种生理病理过程的机制研究。本文将详细介绍Transwell细胞迁移实验的标准操作流程、关键注意事项及常见问题解析，旨在为科研工作者提供一份实用的操作指南。

一、实验原理

Transwell迁移实验的基本原理是将Transwell小室（内含一张多孔的聚碳酸酯膜或聚酯膜）置于培养板的孔中。实验时，将待研究的细胞接种于小室的上室，而下室则加入含有趋化因子（如特定细胞因子、生长因子或血清）的培养液。由于下室存在吸引细胞迁移的物质，上室的细胞会受到趋化信号的刺激，开始向膜的下表面迁移。经过一定时间的培养后，未迁移的细胞被轻轻擦去，而成功穿过膜孔并附着在膜下表面的细胞则被固定、染色，最终通过计数这些细胞来评估其迁移能力。膜的孔径大小和材质需根据所研究细胞的类型和大小进行选择。

二、实验准备

（一）主要试剂与材料

1.细胞系：处于对数生长期的目的细胞。

2.Transwell小室：根据细胞大小选择合适孔径（常用的有8μm，具体需参考相关文献或预实验），常见品牌如Corning、BD等。

3.细胞培养液：

*无血清培养液或低血清培养液（用于上室悬浮细胞，减少血清中非特异性成分的干扰）。

*含血清培养液或添加了特定趋化因子的完全培养液（用于下室，提供趋化信号）。

4.固定液：常用4%多聚甲醛（PFA）溶液或甲醇。

5.染色液：0.1%结晶紫溶液是最常用的，有时也会用到苏木精-伊红（HE）染色或台盼蓝染色。

6.PBS缓冲液：用于洗涤细胞。

7.无水乙醇或乙酸：若使用结晶紫染色，可用于后续的脱色（如需定量）。

8.胰蛋白酶-EDTA消化液：用于消化收集细胞。

（二）主要仪器与耗材

1.CO?培养箱：用于细胞培养孵育。

2.超净工作台：确保无菌操作。

3.倒置显微镜：用于观察和计数迁移细胞。

4.离心机：用于细胞离心收集。

5.移液器及配套无菌吸头：不同量程。

6.24孔细胞培养板：用于放置Transwell小室。

7.无菌镊子：用于夹取Transwell小室。

8.棉签或专用细胞刮：用于擦去上室未迁移的细胞。

9.微量加样器。

（三）细胞准备

1.实验前确保细胞处于良好的生长状态，无污染，汇合度适中。

2.用预热的PBS洗涤细胞1-2次。

3.加入适量胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃培养箱中孵育至细胞变圆、脱落。

4.加入含血清的完全培养液终止消化，轻轻吹打制成单细胞悬液。

5.将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm左右离心5分钟，弃上清。

6.用无血清培养液（或实验要求的特定培养液）重悬细胞沉淀，轻轻吹打均匀。

7.进行细胞计数，并调整细胞浓度至实验所需密度（通常需通过预实验确定合适的接种密度，以避免细胞过度迁移或迁移过少影响计数）。

三、实验步骤

（一）Transwell小室的预处理（如需要）

*常规迁移实验：通常无需特殊预处理。但部分实验室习惯用无血清培养液或PBS轻轻润洗小室的膜，以去除可能残留的防腐剂或杂质，并使膜水化。操作时注意不要用力过猛，避免损坏膜。润洗后可将小室置于24孔板中，吸去多余液体。

*注意：此处需特别区分迁移实验与侵袭实验。侵袭实验通常需要在膜的上表面铺被Matrigel等基质胶，以模拟细胞外基质环境，而标准的迁移实验则不需要此步骤。

（二）细胞接种与趋化因子添加

1.下室加液：向24孔板的每个孔（即Transwell小室的外室）中加入适量含趋化因子的培养液（如下室加入500μL含10%FBS的DMEM）。注意避免产生气泡，若有气泡需轻轻吹打去除，因为气泡会影响细胞的迁移和观察。

2.上室接种细胞：用无菌镊子小心将Transwell小室放入已加入下室培养液的24孔板孔中。然后，向上室（即小室内部）加入调整好浓度的细胞悬液（例如每孔加入200μL细胞悬液，细胞数根据预实验结果确定，通常在1x10?至1x10?细胞/孔之间）。加样时，将移液器吸头轻轻靠近小室中央的膜上方，缓慢加入，避免将液体溢出到小室外，同时避免产生气泡。

3.培养孵育：将24孔板小心放入37℃、5%CO?的培养箱中进行孵育。孵育时间根据细胞类型和迁移能力而定，通常为6-24小时（例如，某些肿瘤细胞可能6-12小时即可，而一些迁移能力较弱的细胞可能需要18-24小时）。具体时间需通过预实验优化，以确保在大部分细胞已迁移且未出现过度堆叠或增殖影响结果为准。

（三）固定与染色

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