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pBR322质粒构建关键步骤细化实操+问题解决方案

聚焦酶切体系优化、连接效率提升、测序结果比对三个核心步骤，补充精准实操参数、标准化操作流程及常见问题的排查与解决方法，可直接用于实验室实操指导。

一、酶切体系优化（单酶切/双酶切）

酶切是载体构建的基础，酶切效率直接决定后续连接成功率，核心优化方向为缓冲液匹配、酶量控制、反应条件调整，以下是分类型的细化实操方案。

（一）单酶切体系（20μL，载体/元件DNA通用）

试剂

体积（μL）

精准参数要求

作用说明

ddH?O

补至20

无核酸酶污染（DEPC处理或超纯水）

定容，避免外源核酸污染

10×酶切缓冲液

2

与所