快速分离哺乳动物DNA方法与材料.pdfVIP

速

快分离哺乳动物

约瑟夫・桑布鲁克和大卫・W・拉塞尔

本协议改编自《分子克隆》，第三版，作者：约瑟夫・桑布鲁克和大卫・W・拉塞尔。冷泉港

社，纽约州冷泉港，，2001年

引言

哺乳物按照本协议从血液或组织中的大小为20‑50kb，适用于用作PCR中的模板。的产量

动

在0.5到3.0μg/毫克组织之间，或每300μl全血为5到15μg。

材料

无RNase的(4mg/ml)

乙醇

可选，请参见步骤5。

异丙醇

哺乳动物组织

醋酸钾（5M）

蛋白酶K（20mg/ml）

使用的组级别的蛋白酶K，已证明其不含酶和RNase活性。

快速哺乳动物细胞裂解缓冲液

TE（pH7.6）

Tris‑Cl（20mM，pH7.6）

全血的

方法

RapidIsolationofMlian

JosephSambrookandDavidW.Russell

ThisprotocolwasadaptedfromMolecularCloning,3rdedition,byJosephSambrook

andDavidW.Russell.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,

USA,2001

INTRODUCTION

Mlianpreparedfrombloodortissuesasdescribedinthisprotocolis20-50kbinsizeandsuitableforuseasatemteinPCRs.Theyields

ofvaryween0.5and3.0µg/mgtissueor5and15µgper300µlofwholeblood.

MATERIALS

se-freeRNase(4mg/ml)

Ethanol

Optional,pleaseseeStep5.

Isopropanol

Mliantissue

Potassiumacetate(5M)

ProteinaseK(20mg/ml)

UseofagenomicgradeproteinaseKthathasbeenshowntobefreeofseandRNaseactivity.

Rapidmliancelllysisbuffer

TE(pH7.6)

Tris-Cl(20mM,pH7.6)

Wholebloodofinterest

METHOD

1.准备组织或全血用于组分离。对于组织ue

取10‑20毫克的组织。

使用剃刀/手术刀将组织切碎，或在液氮中冷冻组织，然后在预冷的研钵中研磨成粉末，具体操作参见高分子量从哺乳动物细胞中使用蛋白酶K和

苯酚。

对于血液

将300‑μl全血的样本转移到每个的两个微量离心管中。向每个管中加入900μl的20mMTris‑Cl（pH7.6），盖紧管盖后翻转混匀。在室温下孵育10分钟，期

间偶尔翻转离心管。

在室温下以最大速度离心20秒。

弃去每个上清液，仅保留20μl。

将白细胞沉淀在每个试管中剩余的少量上清液中重新悬浮。将重新悬浮的细胞沉淀合并到一个试管中