2026年荧光定量的基础知识点.docxVIP

2026年荧光定量的基础知识点

一、荧光定量核心定义与本质（基础必记）

荧光定量（Real-TimeQuantitativePolymeraseChainReaction，简称qPCR），是在常规PCR扩增基础上，加入荧光信号检测模块，实时监测PCR扩增过程中荧光信号的变化，通过荧光强度定量分析样本中目的核酸（DNA或RNA）初始浓度的分子生物学技术。

核心本质：区别于常规PCR“终点定性检测”的局限，荧光定量实现了“实时监测、定量分析”，核心是通过荧光信号与扩增产物量的线性关联，推算出样本中目的核酸的原始拷贝数，兼具高灵敏度、高特异性、快速高效、可定量的优势，是分子生物学检测中最常用的核心技术之一。

关键补充：荧光定量的核心原理围绕“PCR扩增”与“荧光信号检测”的结合——PCR扩增过程中，每完成一次循环，目的核酸量就会呈指数级增加，荧光信号也会同步增强，通过记录每个循环的荧光强度，绘制扩增曲线，进而实现定量分析，广泛应用于医学检测、微生物检测、基因表达分析等领域。

二、荧光定量的核心原理（重点掌握）

荧光定量的原理基于PCR扩增的基本规律和荧光信号的特异性检测，核心分为“PCR扩增原理”和“荧光信号检测原理”两部分，两者协同作用，实现目的核酸的实时定量，新手需重点掌握两者的关联的及核心要点。

（一）基础：PCR扩增原理

PCR（聚合酶链式反应）是荧光定量的基础，核心是通过DNA聚合酶的作用，在体外模拟体内DNA复制过程，实现目的核酸片段的指数级扩增，为荧光信号检测提供足够的扩增产物。

1.核心扩增步骤（循环进行，通常30-40个循环）：①变性（90-95℃，10-30秒）：将模板DNA双链加热至高温，使双链解旋，形成单链DNA，为引物结合做准备；②退火（50-65℃，30秒-1分钟）：降温至引物的最适结合温度，让特异性引物与模板单链的互补序列结合，形成引物-模板复合物；③延伸（72℃，30秒-1分钟）：DNA聚合酶（常用Taq酶）以引物为起点，按照碱基互补配对原则，催化dNTP（脱氧核苷三磷酸）聚合，合成与模板互补的新链，完成一次扩增。

2.扩增规律：理想状态下，每完成一个循环，目的核酸的量就会翻倍（2?，n为循环数），但随着循环数增加，引物、dNTP等原料消耗，扩增效率会逐渐下降，进入平台期，荧光定量的定量分析主要基于扩增的指数期（对数期）。

（二）核心：荧光信号检测原理

荧光信号检测是荧光定量实现“定量”的关键，核心是通过荧光染料或荧光探针，特异性结合PCR扩增产物，随着扩增产物量的增加，荧光信号强度同步增强，仪器实时采集荧光信号，转化为可分析的数值和曲线。

1.荧光信号产生的核心逻辑：荧光物质（染料或探针）本身无荧光或荧光微弱，当结合到PCR扩增产物（双链DNA）上后，荧光信号会显著增强，且荧光强度与扩增产物的量呈正相关——扩增产物越多，荧光信号越强，通过监测荧光强度的变化，即可反映扩增产物的生成情况。

2.关键概念：①荧光阈值（Threshold）：人为设定的一个荧光强度值，用于判断扩增信号是否为有效信号（高于阈值的信号视为有效扩增信号，低于阈值的视为背景噪音）；②Ct值（Cyclethreshold，循环阈值）：扩增过程中，荧光信号首次达到设定阈值时所经历的循环数，是荧光定量定量分析的核心指标——Ct值与目的核酸初始浓度呈负相关，初始浓度越高，Ct值越小；初始浓度越低，Ct值越大。

三、荧光定量的核心分类（按检测方法，重点区分）

根据荧光信号检测方式的不同，荧光定量主要分为“荧光染料法”和“荧光探针法”两大类，两者在检测原理、特异性、适用场景上存在差异，新手需重点区分，根据实验需求选择合适的方法。

（一）荧光染料法（SYBRGreenI法，最常用）

荧光染料法是最基础、最常用的荧光定量方法，核心使用非特异性荧光染料，结合所有双链DNA，实现荧光信号的检测，操作简便、成本较低，适合常规定量检测。

1.核心原理：SYBRGreenI是一种双链DNA特异性荧光染料，游离状态下荧光微弱，当结合到PCR扩增产生的双链DNA小沟中时，荧光信号会增强1000倍以上，荧光强度与双链DNA的量呈正相关，通过监测荧光强度，即可反映扩增产物的量。

2.优势与不足：①优势：操作简便，无需设计特异性探针，成本低，适用于大量样本的快速检测，可用于熔点曲线分析（判断扩增产物的特异性）；②不足：特异性较低，染料会结合所有双链DNA（包括引物二聚体、非特异性扩增产物），易产生假阳性信号，不适合复杂样本（如含有大量杂核酸的样本）的检测。

3.关键补充：染料法检测后，通常需要进行熔点曲线（MeltingCurve）分析，通过缓慢升温，观察荧光信号的下降曲线——特异性扩增产物