「ELISA问诊室」复孔数据要“蹦迪”？四步分析法让你的CV值稳稳当当.pdfVIP

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「ELISA问诊室」复孔数据要“蹦迪”？

四步分析法让你的CV值稳稳当当

做ELISA最崩溃的瞬间是什么？不是加样加到手腕酸痛，也不是孵育

等到地老天荒——而是复孔数据像开盲盒一样忽高忽低，CV值直

接爆表！

CV（即变异系数，CoefficientofVariation）是直观反映检测结果

离散程度的指标。计算公式为：

CV%(标准差SD/平均值Mean)x100%

CV值既能评估同一块板的板内精密度，又能评估不同批次板间精密

度。CV值越小，实验重复性越好。

板内CV10%，板间CV15%，优秀，放心用。板内CV15%，板间CV20%，

可接受范围。CV20%，数据不可用，需排查原因。

「ELISA问诊室」第12期，将为大家解答ELISA实验中复孔差异相

关的常见问题，帮你从源头揪出CV值作妖的真凶，手把手教你把

复孔差异降到10%以内。

4大翻车原因+全解决方案

CV值偏高涉及多种因素，从样品处理到数据分析，每个环节都可能

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影响ELISA结果的可靠性。通过样本处理保存、优化操作细节、关键

试剂质控、仪器定期校准等，有效降低CV值，让你的结果从此告别

“过山车”，稳如泰山！

1、样本问题（样品降解、杂质干扰、浓度不合适）

ELISA可检测样本范围十分广泛，比如血液（血清、血浆）、组织匀

浆或提取物、细胞培养上清、细胞裂解液、分泌物（唾液、乳汁）、

排泄物（尿液、大便）等，甚至还可以检测土壤中的蛋白样品。不同

类型样本的处理方法也大相径庭。

新鲜样本要及时处理，并分装保存，避免反复冻融，造成样本降解。

比如血液样本，要在采集后24小时内进行处理，收集和处理时要避

免红细胞破裂溶血，不使用高血脂样本。整个过程避免细菌污染。所

有样本收集后，应及时分装并储存于-20℃或-80℃。在检测前，冻存

样本应缓慢恢复至室温。轻柔的混匀。如果有可见的沉淀需要再次离

心去除。

样本浓度不宜过高或过低，OD值应在标准曲线范围内，最好是在中

间段。浓度过高可进行倍比梯度稀释，计算浓度时乘以样本稀释倍数。

如果浓度太低，可浓度样本，或者更换灵敏度更高的试剂盒。

2、操作细节（加样误差、孵育不足、洗板不当）

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手动加样可能会存在误差，比如移液器未校准或操作不规范，枪头未

插紧或有残留液体。不同操作人员加样手法不一样（如快吸快打）。

所以要对实验人员进行标准化培训，加强基本功训练，还需定期校准

移液器。

手抖党看这里！将移液器枪头45°贴壁，可以防止枪头抖动。还可

以将手肘撑在桌面或超净台外边沿，使手臂、移液器和桌面之间形成

三角，稳稳地加样。如果还手抖，可以用另一只手紧握持移液器手的

手腕，使两个手臂和桌面之间形成稳固的三角。

孵育条件不稳定，比如温度波动较大，可能会造成板间CV值大。建

议使用恒温孵育箱（37℃±0.5℃），精准控温控时，减少频繁开盖。

孵育时要盖封板膜，减少孔内液体蒸发。

手动洗板时一般加入300-350μL1X洗涤液，静置30秒至1分钟后

立即甩干，重复洗板3-5次。洗涤过程中，洗涤液不要溢出板孔，以

免污染相邻的孔。特别是高浓度孔污染低浓度孔或空白孔，会造成复

孔间CV值变大。

甩板时，手腕不要左右摇摆或旋转，应迅速翻转倒液，重复2-3次确

保甩净。使用干净的吸水纸、滤纸或无尘布，不要使用卫生纸，细小

粉尘或碎屑容易吸附到孔底，导致洗板不干净，结果偏高或偏低，影

响复孔数值。

如果机洗，需要定期校准洗板机，检查洗板机是否有堵塞，确保每孔

洗涤均匀。

3、试剂、耗材问题

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抗体、酶标二抗或底物反复冻融也会导致活性下降，抗