「ELISA问诊室」标曲R2小于0.99？你的ELISA数据正在“说谎”！看懂ELISA自查表，贴在冰箱保平安！.pdfVIP

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「ELISA问诊室」标曲R20.99？你的

ELISA数据正在“说谎”！看懂ELISA自查

表，贴在冰箱保平安！

ELISA把酶化学反应的敏感性与抗原抗体反应特异性合二为一，但实

验做的再漂亮，可能一条“歪”的标准曲线就让数据翻车了。接下来

我们就用3分钟，将标准曲线这条“红线”掰扯透彻。

「ELISA问诊室」第11期，将为大家解答标准曲线相关的常见问题。

一、合格的标曲长啥样？

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标准曲线是ELISA实验的核心，判断数据可靠性的第一道关卡。标准

曲线是用已知浓度的标准品制作出来的“参考线”，是计算样本浓度

的基础。

该怎么判断标准曲线是否符合要求呢？

2

首先看R值是否符合要求。

R值（R-squared，也称为决定系数）是衡量标准曲线拟合优度的重2

要指标。R2值范围从0到1。越接近1，说明标曲与实验数据之间的

2

吻合度越高，拟合效果越好。在ELISA实验中，要求R值≥0.99，确

保标曲线性关系良好，结果可靠。如果低于0.95就可能存在加样不

准、标准品失效、洗板不彻底等问题。

其次看标准品OD值梯度变化是否明显。

标准品的OD值应按照浓度从高到低依次下降。如果某个浓度的OD值

与上一浓度持平或下降太多，可能是操作失误。

第三看空白对照OD值是否满足足够低。

空白对照的OD值一般应小于0.1。如果空白值偏高，可能是清洗不

彻底或者试剂浓度使用偏高，需要调整配比。

最后看实验设计是否有复孔。

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ELISA实验要做复孔（一般2-3孔），两孔之间的差异用变异系数CV

值评定。如果某个样品的复孔OD值一个天一个地，很可能是孔内有

气泡、样品中有杂质或者枪头堵了。

CV＜10%数据可靠

10%＜CV＜15%数据可接受，但建议复测

CV＞15%数据不可用，可能存在操作失误

二、看似合理的数据，也可能是个“坑”！

比如假阳性，明明不该有数值却测出来了，原因可能是样品中有干扰

物质（溶血、脂血）、非特异性结合、封闭不彻底，可以对样品进行

稀释或更换封闭液。同理如果出现假阴性，则需要对样品进行浓缩、

更换高灵敏度试剂盒或查看抗体有效期。

OD值并不是越高越好。如果样品的OD值“爆表”了，超过标曲最高

点，算出来的浓度是不准确的，需要将样品进行稀释重测。当然，OD

值趋于0也说明目的蛋白浓度太低，可能低于检测下限，可尝试对样

品进行浓缩处理。

三、标曲崩了，先查这三种原因！

标准品可以看作是一系列已知目标蛋白浓度的阳性对照。如果能够看

到标准品的信号，且其浓度降低时信号也会减弱，说明ELISA检测正

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常有效。反之，则需要调整ELISA的操作和检查试剂了。比如空白孔

OD值＞0.1，可能是有一定的背景存在。

标准曲线无梯度或梯度不明显、读数过低或过高，可能由多种因素相

关，比如标准品稀释不准确、加样或试剂操作不规范、洗涤操作不充

分、交叉污染等等。具体分为以下几种情况：

1、标准品相关

主要存在的问题有标准品复溶不当、稀释配置错误、降解。

大多数标准品为冻干粉，在复溶时要严