「ELISA问诊室」开端不迷茫：从包被缓冲液到特殊抗原，科研老司机总结的翻车自救指南！.pdfVIP

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「ELISA问诊室」开端不迷茫：从包被缓

冲液到特殊抗原，科研老司机总结的翻车

自救指南！

ELISA是以96孔板为固相载体的免疫学实验技术，抗体筛选、效价

测定、蛋白互作、诊断试剂开发等都需要它，几乎在任何实验室都能

看到它的身影。

商品化的ELISA试剂盒基本是预包被抗体或抗原的，可直接用于实验

操作，但大多数属于双抗夹心法，并不能满足实验室千变万化的ELISA

实验需求。因此很多实验人员自己动手，“丰衣足食”，根据实验需求

DIY酶标板。

「ELISA问诊室」第8期，将为大家介绍酶标板制备中的第一步操作

——包被。

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一、DIY自己的酶标板

酶标板的制备主要有包被、封闭、干燥三步操作。

包被是将抗原或抗体吸附到固相载体表面的过程，通过蛋白质结

构上的疏水基团与载体表面的疏水基团相互作用力结合，属于非

特异性物理吸附。这种吸附与蛋白质的分子量、等电点、浓度等

有关。

包被需要选择合适的缓冲液。包被缓冲液一是维持蛋白质稳定性，

避免其变性或聚集，二是提供合适的pH环境，使蛋白带正电荷，

促进与带负电的固相载体结合。

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传统的包被缓冲液是50mMpH9.6的碳酸盐缓冲液。随着ELISA

技术的发展，大家有了新的认知，一般会在酸性、中性、碱性缓

冲液中进行筛选，以达到蛋白稳定性和包被效率间的平衡。

附50mMpH9.6的碳酸盐缓冲液配方：将1.59gNaCO和2.93g

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NaHCO3溶解于去离子水中，定容至1000mL。

包被的时间和温度主要取决于ELISA的使用场景。如果是要快速得到

验证性结论，可以在37℃包被2小时。如果是批量生产制备，考虑

到板间差异需要低温过夜，一般是4℃包被过夜。包被的浓度与载体

和包被物的性质有关，需要通过预实验确定，一般蛋白质的包被浓度

为0.1-10μg/mL。

在准备好包被缓冲液后就可以进行包被了，一般用50mMpH9.6

的碳酸盐缓冲液将抗体或蛋白质稀释至0.1-10μg/mL。在每个酶

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标板反应孔中加100μL包被混合液，覆盖薄膜，4℃过夜或37℃2

小时静置包被。

包被完成后需要清洗掉过量的或未牢固结合的组分，清洗次数需

要摸索。一般操作为：每孔中加入300μL洗涤液（pH7.4

PBS+0.05%Tween-20），浸泡30s-2min，然后倒液、拍板，重复

3-5次。也可选择用洗板机洗涤。

洗板后还需进行封闭。在每个孔中加入200μL封闭液，用封口膜

覆盖酶标板室温孵育1-2小时，洗板2-3次。封闭液可以是含5%

脱脂奶粉PBS缓冲液，也可以是其他封闭剂，如BSA、酪蛋白、

明胶、血清等。为了提高稳定性，有时会在封闭液中添加一定量

的蔗糖或海藻糖。

二、固相载体就是酶标板

固相载体是ELISA实验中的支撑物和容器，不参与化学反应。固相载

体样式主要有3种：微量滴定板、磁珠和小试管，其中以微量滴定板

最为常用，即常说的酶标板。酶标板一般为96孔，分为整体式和可

拆式。可拆式为8联孔条或12联孔条，方便少量样本的检测。

酶标板主要材质是聚苯乙烯（PS），通过疏水键、离子键或共价结合，

将抗原/抗体等吸附到孔内表面。聚苯乙烯具有较强吸附性能，且吸

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