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专题1基因工程

基因工程概念:

基因工程又名DNA重组技术或转基因技术

原理：基因重组

水平:ＤNA分子水平

操作对象：基因

特点:按照人们的意愿，定向变化生物性状

1、1基因工程的基本工具

1、基因工程:是指按照人们的愿望，进行严格的设计，经过体外ＤNA重组和转基因技术,赋予生物以新的遗传特征，发明出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNＡ重组技术。原理是基因重组。

2、基因工程的基本工具：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、载体

３、限制性核酸内切酶(限制酶）

（1)起源：重要是从原核生物中分离纯化出来的。

(2）功效特点:

可以识别双链ＤNA分子的某种特定的核苷酸序列；

使每一条链中特定部位（识别位点）的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开

成果：形成黏性末端和平末端

例子：ＥcoRⅠ、SmaⅠ

4、DNA连接酶

(1)两种DNA连接酶：Ｅ.ｃoliDNA连接酶和T4DＮA连接酶

①相同点：都缝合磷酸二酯键。

②区别:T4DNＡ连接酶起源于Ｔ4噬菌体，可以连接粘性末端和平末端

Ｅ.coｌiＤNA连接酶起源于大肠杆菌，只能连接粘性末端

5、载体

(1）载体具备的条件:①能在受体细胞中复制并稳定保存。

②具备一至多个限制酶切点，供外源DNＡ片段插入。

③具备标记基因，供重组DNＡ的鉴定和选择。

（2）载体种类：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒

最常用的载体是?质粒,它是一个裸露的、结构简朴的、独立于细菌染色体之外，并具备

自我复制能力的双链环状DNＡ分子。

真正用作载体的质粒,都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。

改造后的质粒结构:一个或多个酶切位点;复制原点;标记基因

1、2基因工程的基本操作程序

1、基因工程的基本操作程序:

目标基因的获取

基因体现载体的构建（关键)

将目标基因导入受体细胞

目标基因的检测与鉴定

2、目标基因:编码蛋白质的结构基因

3、目标基因的起源：①从自然界已有的物种中分离②人工方法合成

4、获取目标基因的常用方法:

从基因文库中获取（基因组文库,cDNＡ文库)

运用PＣR技术扩增

人工合成（反转录法_和化学合成法。适合基因较小,序列已知）

5、ＰCR技术:

概念：PCR全称为多聚酶链式反映，是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。

原理：DNA复制

条件：模板ＤNＡ、DNA引物、热稳定DNＡ聚合酶(Taq酶）、四种脱氧核苷酸

成果:以2n指数形式扩增

过程:高温变性(9０~95℃）、低温退火（55～60℃）、适温延伸（７０~75℃）循环反复

6、基因体现载体的构建的目标:使目标基因在受体细胞中稳定存在,可以遗传至下一代,使目标基因可以体现和发挥作用。

7、重组DNA(重组质粒)的构成:目标基因+开启子＋终结子+标记基因

(1）开启子：是一段有特殊结构的ＤNA片段,位于基因的首端，是ＲNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出ｍRNA，最终取得所需的蛋白质。

(２)终结子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。使转录停顿

(3）标记基因的作用:是为了鉴定受体细胞中是否含有目标基因,从而将含有目标基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。

8、转化的概念：是目标基因进入受体细胞内，而且在受体细胞内维持稳定和体现的过程。

9、将目标基因导入植物细胞

农杆菌转化法：

合用植物：双子叶植物、裸子植物

作用特点：农杆菌中的Tｉ质粒上的T-ＤNA可整合到受体细胞的染色体ＤＮA上。将目标基因插入到Ｔi质粒上的T－DNＡ上,即可在受体细胞内稳定遗传和体现

基因枪法(微弹轰击法)：单子叶植物常用的转化方法。成本较高

花粉管通道法:我国独创。成功例子：抗虫棉

10、将目标基因导入动物细胞方法:显微注射法；此方法的受体细胞多是受精卵。

11、将目标基因导入微生物细胞

原核生物作为受体细胞的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质较少

转化的关键:Ca２+解决，使细胞成为感受态细胞(容易吸收周边环境中的DNA分子）

生物种类

植物细胞

动物细胞

微生物细胞

常用方法

农杆菌转化法

显微注射技术

Ｃa2+解决法

受体细胞

体细胞

受精卵

原核细胞

转化过程

将目标基因插入Tｉ质粒的T—DNＡ上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNＡ→体现

将含有目标基因的体现

体提纯→取卵(受精卵）→显微注射→受精卵发育→取得具备新性状的动物

Ca2+解决细胞→微生物细胞壁的通透性增加→感受态→重组质粒与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子

12、目标基因的检测和鉴定

(1)检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目标基因:方法是DNA分子杂交技术。

(2)检测目标基因是否转录