牡丹远缘杂交及其部分杂交后代AFLP分子标记鉴定研究.docxVIP

牡丹远缘杂交及其部分杂交后代AFLP分子标记鉴定研究

一、引言

二、材料与方法

2.1实验材料

用于远缘杂交的牡丹亲本材料选用了‘凤丹白’和‘紫斑牡丹’。‘凤丹白’来源于河南洛阳牡丹种植基地，属于江南牡丹品种群。其植株高大直立，枝干粗壮，叶片宽大且浓绿，花朵白色，单瓣型，花径较大，通常在15-20厘米左右，花期一般在4月中旬，具有较强的适应性和抗逆性，是常见的牡丹杂交育种材料。‘紫斑牡丹’引自甘肃兰州，为西北牡丹品种群的代表种。其植株形态优美，叶片狭长，背面有白色绒毛，花朵大而艳丽，花瓣基部具有明显的紫色斑块，这是其显著的生物学特征。花型多样，有单瓣、半重瓣和重瓣等，花期稍晚于‘凤丹白’，大约在4月下旬，具有耐寒、耐旱等特性。

实验所需的各类试剂包括：CTAB提取液、氯仿-异戊醇（24:1）、无水乙醇、70%乙醇、RNaseA、10×PCRBuffer、dNTPs、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶EcoRI和MseI、T4DNA连接酶、ATP、引物等，以上试剂均购自国内知名生物试剂公司。仪器设备主要有：高速冷冻离心机、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、恒温培养箱、超净工作台等，仪器品牌涵盖国内外主流厂家，确保实验数据的准确性和可靠性。

2.2实验方法

2.2.1牡丹远缘杂交

在亲本选择上，充分考虑了‘凤丹白’和‘紫斑牡丹’的生物学特性和遗传差异，以期望获得具有优良性状的杂交后代。‘凤丹白’作为母本，因其花型较大，便于操作，且具有良好的结实能力；‘紫斑牡丹’作为父本，其独特的花色和抗逆性是杂交育种期望引入的性状。

花粉采集于‘紫斑牡丹’花朵即将开放但尚未散粉时，将花药取下，放置于干燥的培养皿中，在室温25℃左右、相对湿度40%-50%的条件下阴干，待花药开裂散出花粉后，收集花粉并装入干燥的离心管中，置于-20℃冰箱保存备用。

授粉时期的确定对于杂交成功率至关重要。通过观察‘凤丹白’花朵的发育状态，当柱头分泌黏液，且呈光亮湿润状态时，表明柱头已具备接受花粉的能力，此时为最佳授粉时期，一般在花朵开放后的第2-3天。

授粉操作在超净工作台上进行，先用镊子轻轻去除母本花朵的雄蕊，避免自花授粉，然后用毛笔蘸取适量父本花粉，均匀涂抹在母本柱头上，授粉后立即用硫酸纸袋套袋隔离，防止其他花粉污染，并挂上标签，注明杂交组合、授粉日期等信息。本次实验共设置了‘凤丹白’ב紫斑牡丹’这一杂交组合，授粉数量为50朵花。

2.2.2杂交后代的获得与培育

杂交果实的采收在授粉后约60-70天，当果实由绿色变为黄褐色，且果荚开始开裂时进行。采收后的果实置于通风干燥处阴干，待果荚完全开裂后，取出种子。将种子用清水冲洗干净，去除杂质，然后用50℃左右的温水浸泡24小时，以打破种子休眠。

播种前，准备好疏松肥沃、排水良好的育苗基质，将浸泡后的种子均匀撒播在基质表面，覆盖一层1-2厘米厚的基质，轻轻压实。将育苗盆放置在恒温培养箱中，温度控制在25℃左右，保持基质湿润。待种子发芽出土后，将其转移至温室中进行培育，温室温度控制在20-25℃，光照强度保持在2000-3000lux，定期浇水、施肥，施肥以稀薄的复合肥溶液为主，每隔15-20天施一次肥，同时注意病虫害的防治，确保杂交后代的正常生长。

2.2.3DNA提取与检测

采用CTAB法从牡丹叶片中提取基因组DNA。取新鲜的牡丹叶片约0.5克，置于预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉末状。将粉末转移至1.5毫升离心管中，加入600微升预热至65℃的CTAB提取液，轻轻颠倒混匀，然后置于65℃水浴锅中保温30-60分钟，期间每隔10-15分钟轻轻颠倒混匀一次。

保温结束后，取出离心管冷却至室温，加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀10-15分钟，使蛋白质等杂质充分沉淀。然后在12000转/分钟的条件下离心10-15分钟，将上清液转移至新的离心管中。重复上述氯仿-异戊醇抽提步骤1-2次，直至界面无白色沉淀。

向上清液中加入2/3体积预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，可见白色絮状DNA沉淀析出。在12000转/分钟的条件下离心5-10分钟，弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2-3次，每次洗涤后离心3-5分钟，弃去上清液。将离心管置于通风处晾干，待DNA沉淀完全干燥后，加入适量的TE缓冲液溶解DNA，同时加入RNaseA，终浓度为10微克/毫升，37℃水浴30分钟，以去除RNA杂质。

DNA的纯度和浓度检测通过