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抗SEA卵黄抗体的制备及其对日本血吸虫循环抗原检测的探索性研究

一、引言

1.1研究背景

血吸虫病是一种严重危害人类健康的全球性寄生虫病，在热带和亚热带地区广泛流行。据世界卫生组织（WHO）统计，全球有超过2亿人感染血吸虫病，每年因血吸虫病死亡的人数达数万人。血吸虫病不仅对患者的身体健康造成严重威胁，还会给社会经济发展带来沉重负担。在我国，血吸虫病主要流行于长江流域及其以南的12个省、市、自治区，历史上曾给疫区人民带来了巨大的痛苦。新中国成立后，经过大规模的防治工作，血吸虫病疫情得到了有效控制，但近年来，由于生态环境变化、人口流动增加等因素的影响，血吸虫病疫情出现了一定程度的回升，防治形势依然严峻。

传统的血吸虫病诊断方法如粪便检查虫卵、直肠黏膜活检等，虽然具有较高的特异性，但敏感性较低，难以检测出早期感染和轻度感染的患者。免疫学检测方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接血凝试验（IHA）等，虽然具有较高的敏感性，但存在假阳性和假阴性的问题，且无法区分现症感染和既往感染。因此，寻找一种更加准确、灵敏、特异的血吸虫病诊断方法具有重要的现实意义。

循环抗原是指寄生虫在宿主体内生长、发育和繁殖过程中释放到血液、组织液或其他体液中的抗原物质。检测循环抗原不仅可以用于血吸虫病的早期诊断，还可以用于判断感染的活动性和疗效考核。日本血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）是一种重要的循环抗原，其成分复杂，包含多种蛋白质和多糖，具有较强的免疫原性。抗SEA卵黄抗体是由SEA免疫产蛋母鸡后，在鸡蛋卵黄中产生的特异性抗体。与传统的抗体来源（如兔、鼠等）相比，卵黄抗体具有产量高、成本低、易于提取和纯化等优点，且其生物学活性稳定，能够在常温下保存较长时间。近年来，卵黄抗体在疾病诊断、治疗和预防等领域得到了广泛的应用，为血吸虫病的诊断提供了新的思路和方法。

1.2研究目的

本研究旨在制备抗SEA卵黄抗体，并建立一种基于抗SEA卵黄抗体的检测日本血吸虫循环抗原的方法，以探讨其在血吸虫病免疫诊断中的应用价值。具体研究目的包括：

制备抗SEA卵黄抗体：通过免疫产蛋母鸡，制备高滴度、高特异性的抗SEA卵黄抗体，并对其进行纯化和鉴定。

建立检测日本血吸虫循环抗原的方法：以抗SEA卵黄抗体为捕捉抗体，结合酶标抗SEA单克隆抗体，建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验（S-ELISA）法，用于检测日本血吸虫循环抗原。

评价检测方法的性能：对建立的S-ELISA法进行敏感性、特异性、重复性等性能评价，并与常规检测抗体的ELISA法进行比较。

初步应用研究：应用建立的S-ELISA法对临床血吸虫病患者和健康人血清进行检测，初步探讨其在血吸虫病免疫诊断中的应用价值。

二、抗SEA卵黄抗体的制备

2.1实验材料

2.1.1实验动物

选用25周龄的健康海兰蛋鸡作为实验动物。海兰蛋鸡具有产蛋率高、适应性强等优点，能够保证实验过程中有充足的鸡蛋供应，以满足大量制备卵黄抗体的需求。在实验开始前，将海兰蛋鸡购入并饲养于清洁、通风良好的鸡舍中，给予充足的饲料和饮水，适应环境1周后，观察其健康状况，确保无异常情况后用于后续实验。

2.1.2抗原

日本血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）为本实验的免疫抗原。该抗原从感染日本血吸虫的动物肝脏中提取获得，主要来源于虫卵释放的多种蛋白质和多糖成分。SEA具有较强的免疫原性，能够刺激动物机体产生特异性免疫应答。其成分复杂，包含多种不同分子量的蛋白质，这些蛋白质在血吸虫感染过程中发挥着重要作用，同时也是检测血吸虫感染的关键标志物。

2.1.3主要试剂和仪器

主要试剂包括弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、灭菌生理盐水、0.01mol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）、海藻酸钠、饱和硫酸铵、考马斯亮蓝G-250、十二烷基硫酸钠（SDS）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）、牛血清白蛋白（BSA）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鸡IgY、3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）底物显色液、终止液（2mol/LH2SO4）等。

主要仪器有电子天平、微量移液器、离心机、超声破碎仪、酶标仪、垂直板电泳槽、转印槽、凝胶成像系统、恒温培养箱、低温冰箱等。

2.2抗体制备步骤

2.2.1免疫方案设计

首次免疫时，将SEA与弗氏完全佐剂按照1:1的体积比充分乳化，使抗原均匀分散在佐剂中，增强抗原的免疫原性。每只海兰蛋鸡经翅膀下静脉注射乳化后的抗原，剂量为60μg/只。10天后进行第一次加强免疫，使用SEA与弗氏不完全佐剂乳化后的抗原，注射剂量为30μg/只，注射途径为皮下多点注射，以扩大抗原在鸡体内的分布范围，促进免疫细胞的接触和活化。之