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免疫组化技术操作要点汇编

免疫组织化学技术，作为病理诊断、基础研究中不可或缺的手段，其结果的可靠性直接依赖于规范化的操作流程与对细节的精准把控。本文旨在梳理关键操作环节，提炼实践经验，为从事相关工作的技术人员提供一份实用的操作指引，以期提高实验成功率与结果可信度。

一、组织处理与切片制备：实验成功的基石

组织处理是免疫组化实验的起点，其质量直接影响后续所有步骤。

1.组织固定：

*及时性：组织离体后应尽快固定，避免自溶和抗原丢失。对于手术标本，理想情况下应在离体后数分钟内开始固定。

*固定液选择：中性缓冲福尔马林（NBF）是目前最常用的固定液，能较好地保存组织结构和抗原性。固定液用量应为组织体积的数倍至十余倍，确保充分固定。

*固定时间与温度：固定时间需根据组织类型和大小调整，通常为数小时至数十小时。室温固定较为常用，特殊情况可低温固定，但需相应延长时间。过度固定可能导致抗原交联遮蔽，需避免。

*固定后处理：固定完成后，组织应经梯度乙醇脱水、透明、浸蜡，最终包埋成蜡块。整个过程应确保组织充分脱水，避免蜡块中残留水分影响切片质量。

2.切片制备：

*切片厚度：常规石蜡切片厚度通常在数微米，过厚易导致细胞重叠，过薄则可能丢失抗原位点或结构不完整。需根据抗体特性和组织类型适当调整。

*切片质量：切片应完整、平整、无褶皱、无刀痕。展片时水温需适宜，避免抗原破坏或组织脱落。

*贴片与烤片：切片应牢固贴附于经防脱处理的载玻片上。烤片温度和时间需严格控制，一般在烤箱内进行，温度不宜过高，时间不宜过长，以防抗原活性丧失或组织焦化。

二、抗原修复：暴露抗原位点的关键

由于固定过程中甲醛的交联作用，部分抗原决定簇可能被掩盖，抗原修复是恢复抗原性的重要步骤。

1.修复方式选择：常用的有热修复和酶修复。热修复效果通常更佳，适用范围更广，如柠檬酸盐缓冲液、EDTA缓冲液等是常用的热修复液，其pH值对修复效果影响显著，需根据抗体说明书推荐选择或优化。酶修复（如胰蛋白酶、胃蛋白酶）多用于某些特定抗原或热修复效果不佳的情况。

2.热修复操作：无论采用微波炉、高压锅还是专用修复仪，均需确保切片在修复液中充分加热至沸腾，并维持一定时间。修复后应自然冷却，避免温差过大导致切片脱落。

3.修复液体积：确保修复过程中切片始终浸没在修复液中，避免干涸。

三、免疫反应：特异性结合的核心

此阶段包括封闭、一抗孵育、二抗孵育等步骤，是免疫组化特异性的核心保障。

1.封闭：

*目的：封闭切片上的非特异性结合位点，减少背景染色。

*封闭液选择：通常使用与二抗来源动物相同的正常血清，或牛血清白蛋白（BSA）等。封闭液中可酌情加入少许吐温-20。

*孵育条件：室温孵育适当时间即可，过长可能反而增加非特异性结合。

2.一抗孵育：

*抗体选择与稀释：选择特异性强、效价高的一抗。严格按照抗体说明书推荐的稀释比例和稀释液进行稀释。抗体的稀释是关键步骤，浓度过高易导致非特异性染色，过低则可能信号微弱甚至阴性。

*孵育条件：一抗孵育时间和温度需仔细控制。常见的有室温孵育数小时或4℃孵育过夜。4℃孵育有助于提高特异性结合，减少背景。孵育时需保持切片湿润，避免抗体干涸。

*孵育环境：应在湿盒内进行，防止切片水分蒸发。

3.洗涤：

*重要性：每步免疫反应后充分洗涤是降低背景、保证特异性的关键。

*洗涤液：通常使用PBS或TBS缓冲液，可加入适量吐温-20（如0.05%）以增强洗涤效果。

*洗涤方式与时间：一般采用振荡洗涤，每次洗涤时间和次数需足够，确保未结合的抗体被充分洗去。

4.二抗孵育：

*匹配性：二抗需与一抗的来源种属和亚型相匹配，并与后续显色系统兼容。

*孵育条件：通常室温孵育，时间较一抗短。同样需在湿盒内进行，避免干涸。

*洗涤：二抗孵育后洗涤要求同前，确保彻底。

四、显色与复染：结果可视化的桥梁

显色是将抗原抗体反应转化为可见信号的过程，复染则为组织结构提供背景对比。

1.显色系统选择：根据二抗标记物选择相应的显色剂，如HRP常用DAB显色，AP常用BCIP/NBT显色。DAB显色需新鲜配制，注意避光。

2.显色控制：显色过程应在显微镜下密切观察，控制显色时间，待阳性信号清晰而背景尚浅时及时终止。显色过度会导致背景加深，影响结果判断。

3.终止显色：使用相应的终止液（如水或特定缓冲液）彻底终止显色反应。

4.复染：常用苏木素复染细胞核，使组织结构更清晰。复染时间和分化程度需适中，避免过深掩盖阳性信号或过浅无法衬托结构。复染后需进行蓝化处理。

5.脱水透明：复染后切片需经