几种生物碱抗乙型肝炎病毒作用及其机理初探.pdfVIP

中Ik1药科人学硕I:学位论文几种r豆了类生物碱抗乙10,11炎病dj作川及其机理初探

BioHil公f]‘、STEPPER公I]产，in);液氮罐，手提蒸气消4锅，冰粕，超低温冰粕等。

2实验方法1-‘4)

2.1试剂配制

(1)RPMI1640培养液250m1:新鲜超纯水配制，含]liiIII(L7，，，10%,G418100pg-ml-1

另力!13%的谷氨酞胺2.5m1,青、链霉素(100u-MI_i储备液)0.5m1，川5%NaHC03调pH

值至7.0,0.22gm滤膜过滤，4C保存。

(2)D一Hanks液II:NaCI8.0g,KCI0.4g,NazHP040.06g,KZHP040.60g,NaHC03

0.35g,酚红0.02g，用超纯水配制成II,高压火菌，4℃保存。

(3)细胞消化液(0.25%胰蛋白酶)100m1:0.258胰蛋白酶干粉(Trysin1:250)溶

于100m1D一Hanks液中，0.22um滤膜过滤，分装，一20℃保存。

(4)0.25%的MTT液配制:100mgMTT溶于40ml的超纯水中，4℃保存。

(5)胎牛血清(FBS):56C30分钟灭活补体后，按10%体积加入培养液中，

一20℃保存。

(6)PBS11:NaCI8g,KCl0.2g,Na2HP0a1.44g,KH2PO40.24g于800ml蒸馏水中，

调pH到7.4，定容到11，高压灭菌20min，室温保存。

(7)细胞冷冻液lOml:含无G418的1640培养液5ml,FBS4ml.DMSO1ml.

2.2细胞培养及传代

(1)细胞复苏:从液氮中取出1支细胞，迅速置于37℃水浴中融化，800-

l000rpm离心5分钟，弃去上清。用1ml含10%FBS1640培养液混悬细胞后，移至

细胞培养瓶中，再补充5ml培养液。置C02培养箱370C5%C02培养24h后换液继续

培养。

(2)细胞扩增:细胞复苏培养约4-7天，待细胞贴壁长满瓶底，进行1:2传

代，以后每4-7天进行1:3传代。

(3)细胞计数:选择生长旺盛的细胞，将培养液弃去，用PBS缓冲液洗一遍，

0.25%胰蛋白酶消化细胞3min后弃去，加约3ml培养液将细胞吹散混悬，取20川加

入细胞记数板，计4个大格细胞数，根据公式计算细胞数:每ml原液细胞数=(4大

格细胞数之和/4)x10个。

(4)细胞接种:将上述细胞悬液用培养液稀释至每毫升含45x100个细胞，将

此细胞0.15ml接种于%孔板中，或24孔板0.5ml1$L.370C5%C02培养24h,细胞长

成单层后进行实验。

(5)细胞冻存:取对数生长期细胞，胰酶消化，离心，去上清，加入冻存液，

计数使细胞密度约为1护个/ml分装于冻存管中，先置于一20℃中2小时再置于一80C

冰箱过夜，次日投于液氮中，以后每隔一个月复苏一瓶检查细胞存活状态。

2.3三种戮对HepG22.2.15细胞毒性实脸

一9-

，}，闪药科人学硕1:学位论文种苦豆了类生物碱抗乙NO汗炎病毒作川及其机理初探

2.3.1给药方法及剂量

IiepG22.2.15细胞稀释液O.15m)/孔接种24h后吸出卜清，根据颅实验结果按如

I`加药方案4%孔板II，加入药物或无药物培养液O.lml:;参总碱浓度为10,5,2.5,

1.25,0.625,0.31mg·ml-1,氧化苦参碱浓度为20,10,5,2.5,1.25,0.625mg·ml

一’，苦参碱浓度为4,2.4,1.44,0.86,0.518mg·ml’，拉米夫定的浓度为2,1.6,

0.8,0.4,0.2,0.1，0.05mg·ml一’，然后每孔再Jai入无G4181640培养液0.15m1,r;k

浓度T{复6孔。

培养93h后，将上清吸出，加入0.25%的MTT液0.03ml,370C0.5%COZ继续培养

3h，甩干培养板，加入二甲亚矾0.1Oml，在微量台式振荡器上振荡1Omin,然后用酶

标仪读出并记录每孔492/630nm的吸光值，观察药物对细胞的毒性，实验重复3次。

2.3.2结果计算

计算药液每浓度复孔的平均吸光度值，.以无药物细胞对照组的平均吸光度值为

100%，计算各浓度下的抑制率，然后按Reed-Meuench法