丝状真菌农杆菌遗传转化及染色技术研究.pptxVIP

;丝状真菌农杆菌遗传转化及染色技术;农杆菌遗传转化;农杆菌遗传转化原理;T-DNA的转移和整合过程依赖于Ti质粒上一系列Vir基因（Virulencegenes）的激活表达协助完成。

Vir基因的表达受到乙酰丁香酮（AS）等酚类物质的诱导。VirA识别AS发生自身磷酸化，然后将磷酸基团转移给VirG使其活化，活化的VirG作为转录因子调控与T-DNA转移相关的操纵子如VirB/C/D/E/F/H等的表达。另外，酸性pH更利于AS对Vir基因的诱导。

农杆菌转化载体系统分为一元载体系统和双元载体系统，两者区别在于T-DNA和Vir基因区是否在同一Ti质粒上。目前应用较多的是双元载体，其构建方法较简单，对外源基因的转化效率也要高于一元载体。;农杆菌介导真菌遗传转化步骤;具体转化步骤（以罗伯茨绿僵菌为例）;质粒转入根癌农杆菌AGL-1

1.将保存于-80℃的农杆菌感受态取出，置于冰上融化10min。

2.加0.5～1μg目的质粒，移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min。

3.液氮速冻5min，37℃温育5min，立即冰浴2min。

4.加入1mL液体YEB，28℃，150rpm培养3h。

5.8000rpm离心2min，弃上清，收集菌体。

6.用100μL液体YEB重悬菌体并均匀涂布在YEB平板上(含50μg/mLCarb和50μg/mLKan)，28℃静置培养2天。

7.挑取转化子用5mL液体YEB(含50μg/mLCarb和50μg/mLKan)，28℃，220rpm培养过夜。PCR验证转化子是否为阳性，最后将阳性菌液保存于-80℃（含15%的甘油）。

;真菌分生孢子孢悬液的制备

1.从培养10天左右的PDA平板上刮取适量的真菌分生孢子到1mL无菌的含0.05%Tween-20水液中，涡旋2～3min。

2.用玻璃丝棉过滤除去菌丝，滤液用1.5mLEpendorf管收集。

3.12000rpm离心3min收集孢子。

4.去上清，用1mL无菌生理盐水（0.85%，w/v）重悬孢子，12000rpm离心3min再次收集孢子。重复本步骤一次。

5.用适量的生理盐水（或无菌水）重悬孢子，血球计数板计算孢子数目，将孢子悬液稀释至106conidia/mL浓度，水悬液一般现配现用，生理盐水悬液可于4℃保存，一周内使用。;真菌转化

1.接种成功转入目的基因载体的AGL-1农杆菌单菌落到4ml液体YEB中（含50?g/mlCarb和50?g/mlKan），28℃，220rpm培养过夜。

2.8000rpm离心3min收集菌体，去上清用适量的IM液体（200μMAS，40mM吗啉乙磺酸）培养基重悬菌体，并将菌液浓度调到在OD600为0.15。

3.28℃，220rpm培养6h左右，菌液OD600达到0.5～0.8。

4.取农杆菌菌液及制备好的孢悬液各100μL，充分混和均匀后涂布于IM（200μMAS，40mMMES）平板（10mL），25℃静置培养48h。

5.取与共培养的IM平板等体积（10mL）的M-100培养基（1%Agar，600μg/ml噻孢霉素和400μg/ml草胺膦）覆盖于IM平板上。

6.25℃培养5～10天至抗性菌落出现。

7.挑取抗性菌落并转移到同样的抗性培养基平板上，进行第二次筛选。

8.从二筛平板上挑出抗性菌落（转化子），抽提基因组并进行PCR验证。;影响农杆菌转化效率的因素;农杆菌遗传转化的优点;真菌染色技术;Nucleusstaining;染色原理;染色步骤（以罗伯茨绿僵菌为例）;染色图片展示;细胞核常用荧光染料有还有：吖啶橙（AcridineOrange，AO）、溴化乙锭（EthidiumBromide，EB）、Hoechst染料、碘化丙啶（PropidiumIodide，PI）、EthDIII等。

AO：具有膜通透性，能透过细胞膜，将核DNA和RNA分别染成绿色和红色，因此使细胞核呈绿色或黄绿色荧光。

EB：一种高度灵敏的荧光染色剂，在标准302nm处激发出橙红色信号。

Hoechst染料：最常见的两种是Hoechst33342和Hoechst33258。这两种染料都在紫外350nm处被激发，在461nm处最大发射光附近发射青/蓝色荧光。与DAPI相比，Hoechst33342加有乙基，具有更强的亲脂性，因此能更好的透过完整的细胞膜，并且细胞毒性更小。

PI：不能穿过活细胞膜，但却能穿过凋亡中晚期的细胞和死细胞的膜而对核染色。PI作为红色荧光复染剂首选，PI经常与Calcein-AM或者FDA等荧光探针合用，区分死/活细胞。

EthDIII