大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的原核表达及早期检测技术创新与应用.docxVIP

大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的原核表达及早期检测技术创新与应用

一、引言

1.1研究背景与意义

大片吸虫病（Fascioliasis）是由大片吸虫（Fasciolagigantica）引起的一种严重的人兽共患寄生虫病。大片吸虫主要寄生于牛、羊等反刍动物的肝脏胆管内，也可感染人类，给畜牧业和公共卫生带来了巨大威胁。

在畜牧业方面，大片吸虫病可导致动物生长发育受阻、生产性能下降、死亡率增加，给养殖业造成了严重的经济损失。感染大片吸虫的牛羊，其体重增长缓慢，产奶量降低，肉品质下降，同时还会增加养殖成本，如治疗费用、饲料消耗等。据统计，全球每年因大片吸虫病造成的经济损失高达数十亿美元。在公共卫生方面，人类感染大片吸虫后，可引起急性或慢性肝炎、胆管炎等疾病，严重影响身体健康。患者常出现发热、腹痛、腹泻、黄疸等症状，严重时可导致肝硬化、腹水甚至死亡。随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，食源性寄生虫病的关注度日益增加，大片吸虫病作为一种重要的食源性寄生虫病，对人类健康的潜在威胁不容忽视。

硫氧还蛋白过氧化物酶（ThioredoxinPeroxidase，TPx）是一类广泛存在于生物体内的抗氧化酶，在维持细胞内氧化还原平衡、抵御氧化应激损伤等方面发挥着重要作用。在大片吸虫中，TPx基因参与了虫体的抗氧化防御机制，对于虫体在宿主体内的生存和繁殖具有关键作用。研究大片吸虫TPx基因的原核表达及早期检测方法，具有重要的理论和实际意义。在理论方面，深入研究TPx基因的结构、功能和表达调控机制，有助于揭示大片吸虫的抗氧化防御机制和致病机制，为进一步了解寄生虫与宿主之间的相互作用提供理论基础。在实际应用方面，建立基于TPx基因的早期检测方法，能够实现大片吸虫病的早期诊断和预警，为疾病的防控提供有力的技术支持。早期诊断可以及时发现感染动物，采取有效的治疗和防控措施，减少疾病的传播和扩散，降低经济损失。此外，原核表达的TPx蛋白还可作为潜在的疫苗候选抗原，为大片吸虫病的疫苗研发提供新的思路和方向。

1.2国内外研究现状

在大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因原核表达方面，国内外学者已开展了相关研究。王俊宁通过对大片吸虫成虫ESTs数据库进行分析，获得了大片吸虫硫氧还蛋白基因，并成功构建表达载体诱导表达。鲍玉芳等对大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因进行原核表达及免疫原性分析，结果表明重组蛋白具有良好的免疫原性。然而，目前对于该基因原核表达条件的优化以及表达蛋白的功能研究仍有待深入。在大片吸虫早期检测方法上，传统的检测方法主要包括粪便虫卵检查法、病理组织学检查法等。粪便虫卵检查法操作简单，但灵敏度较低，难以检测到早期感染；病理组织学检查法虽准确性高，但属于侵入性检查，不适用于大规模筛查。近年来，免疫学和分子生物学检测技术得到了广泛应用，如ELISA、PCR、实时荧光定量PCR等。魏雅婷等分别以TPX、CatB4重组蛋白作为包被抗原，建立了2种检测肝片吸虫血清抗体的间接ELISA方法，为肝片吸虫病的早期诊断提供了必要手段。袁晓丹等对近二十年来片形吸虫病的分子诊断与检测技术的研究进展进行总结，包括基于核糖体DNA、线粒体DNA及全基因组序列的片形吸虫分子鉴定，以及基于这些遗传标记进行PCR诊断、TaqMan探针实时定量PCR、环介导等温扩增试验（LAMP）等检测及诊断方法。但这些方法在特异性、敏感性和实用性等方面仍存在一定的局限性，需要进一步改进和完善。

1.3研究目标与内容

本研究旨在实现大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的高效原核表达，并建立基于该基因的大片吸虫病早期检测方法，具体研究内容包括：

大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的克隆与序列分析：提取大片吸虫总RNA，反转录合成cDNA，通过PCR技术扩增硫氧还蛋白过氧化物酶基因，将其克隆到pMD18-T载体进行测序和序列分析，明确基因的核苷酸序列和氨基酸序列特征。

大片吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的原核表达及条件优化：将测序正确的基因亚克隆到原核表达载体pET-30a(+)中，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，通过IPTG诱导表达重组蛋白。优化诱导表达条件，如IPTG浓度、诱导时间、诱导温度等，提高重组蛋白的表达量。

重组蛋白的纯化与鉴定：采用镍柱亲和层析法对表达的重组蛋白进行纯化，通过SDS和Westernblot鉴定纯化蛋白的纯度和特异性。

基于重组蛋白的大片吸虫病早期检测方法的建立：以纯化的重组蛋白为包被抗原，建立间接ELISA检测方法，优化反应条件，如抗原包被浓度、血清稀释度、封闭液、酶标二抗稀释度等，确定最佳反应条件。对建立的ELISA方法进行特异性、敏感性和重复性试验，评估其检测性