HIS-TAG蛋白质的表达纯化.pdfVIP

蛋白质的表达、分离(fēnlí)、纯化实验的

实验原理和操作步骤

携带(xiédài)有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在

37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组

氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价(ɡònɡjià)偶连

2+

的次氨基三乙酸(yǐsuān)（NTA）使镍离子（Ni）固相化的层析

介质加以(jiāyǐ)提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质

的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

一、试剂准备

1.LB液体培养基：Trytone10g，yeastextract5g，NaCl

10g，用蒸馏水配至1000mL。

2.氨苄青霉素：100mg/mL。

3.上样缓冲液：100mMNaHPO，10mMTris，8MUrea，10

24

mM2-ME，pH8.0。

4.WashingBuffer：100mMNaHPO，10mMTris，8MUrea，

24

pH6.3。

5.ElutionBuffer：100mMNaHPO，10mMTris，8MUrea，

24

500mMImidazole，pH8.0。

6.IPTG：100mMIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g

IPTG溶于100mlddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存(bǎ

ocún)。

二、获得目的(mùdì)基因

1.通过(tōngguò)PCR方法：以含目的(mùdì)基因的克隆质粒为

模板，按基因序列设计一对引物（在上游(shàngyóu)和下游引物分

别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2.通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总

RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为

模板进行PCR循环获得产物。

三、构建重组表达(biǎodá)载体

1.载体(zàitǐ)酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶

切位点）进行(jìnxíng)双酶切，酶切产物(chǎnwù)行琼脂糖电泳

后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2.PCR产物(chǎnwù)双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连

接入载体。

四、获得含重组表达质粒的表达菌种

1.将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗

Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶

切初步鉴定。

2.测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操

作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。

3.以此重组质粒DNA转化表达(biǎodá)宿主菌的感受态细胞。

五、氯霉素酰基转移酶重组(zhònɡzǔ)蛋白的诱导

1.接种含有(hányǒu)重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌

BL21菌株于5mLLB液体培养基中（含100ug/mL氨苄青霉

素），37℃震荡培养(péiyǎng)过夜。

2.按1∶50或1：100的比例稀释过夜菌，一般(yībān)转接1

mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL氨苄青霉素）LB液体培养

基中，37℃震荡培养至OD600=0.6-0.8（最好0.6，大约需3

h）。取10ul样品用于SDS分析。

3.对照组不加诱导剂，实验组加入IPTG至终浓度0.5

mmol/l，37℃继续培养1-3h。

4.12000rpm离心10min，弃上清，菌体沉淀(chéndiàn)保

存于-20℃或-70℃冰箱中。

六、氯霉素酰基转移酶重组(zhònɡzǔ)蛋白(dànbái)的分离、纯化

1.NTA层析柱的准备(zhǔnbèi)：在层析柱中