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化学酶法：开启LNT系列人乳寡糖合成新路径

一、引言

1.1研究背景与意义

母乳，作为婴儿最为理想的食物，含有丰富多样的营养成分，其中人乳寡糖（HumanMilkOligosaccharides，HMOs）在婴儿的生长发育过程中发挥着不可或缺的作用。人乳寡糖是母乳中第三丰富的固体成分，仅次于脂肪和乳糖，占母乳中总糖分的20%-25%左右。尽管人乳寡糖不能为婴儿提供能量，但其具有多种重要的生物学功能。

在免疫系统方面，人乳寡糖能够调节免疫细胞的活性，降低炎症因子的分泌，进而增强婴儿的免疫力。相关研究表明，给食物过敏的小鼠喂食2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL）或6′-唾液酸乳糖（6′-SL），可改善小鼠的腹泻频率和营养不良状况，减少肥大细胞数量和炎症因子的产生。在消化系统中，人乳寡糖作为益生元，能够刺激肠道双歧杆菌和乳酸菌等有益菌群的生长繁殖，维持婴儿肠道微生态平衡。同时，它还可以增强肠道上皮细胞表面粘蛋白的分泌，提高跨上皮电阻（TEER）值，加强肠道屏障功能。例如，在Caco-2细胞和HT-29-MTX细胞的实验中，添加人乳寡糖混合物可使TEER值升高，减少炎症因子对屏障功能的破坏。此外，人乳寡糖在婴儿的神经系统发育中也扮演着重要角色，可能通过唾液酸在肝脏代谢后转运至大脑，参与神经节苷脂和唾液酸糖蛋白的形成，以及结肠细菌代谢人乳寡糖的产物通过迷走神经刺激大脑活动这两种机制，提升婴儿的认知能力。动物实验证实，喂食3′-SL、6′-SL或2′-FL等人乳寡糖的动物，认知能力有所增强。

LNT（lacto-N-tetraose）作为一种四糖元结构的人乳寡糖，是LNT系列人乳寡糖中的重要成员，具有多种生物活性。它可以调节肠道菌群，为有益菌提供生长环境，抑制有害菌的繁殖；还能增强免疫力，帮助婴儿抵抗外界病原体的入侵。然而，牛乳作为婴儿配方奶粉的常用原料，其中人乳寡糖的浓度却远远低于人乳，无法满足婴儿生长发育的需求。从化学或生物途径合成LNT等人乳寡糖，成为了满足市场需求、优化人工乳配方的关键。

目前，合成人乳寡糖主要有化学合成和酶合成两种方法。化学合成虽然成功合成了一些人乳寡糖，但存在合成步骤繁多、成本高、纯度低等问题。而酶合成是一种绿色环保、高效、特异性强的方法，但仍面临复杂的酶工程问题和高成本的挑战。化学酶法合成人乳寡糖作为一种新兴的方法，结合了化学合成和酶合成的优点，具有反应温度和反应条件易于控制的能力，被认为具有制备不同结构型人乳寡糖的潜力。通过将种子源或简单的糖类底物与适当的化学试剂或酶催化剂反应，可在单个容器内合成多种结构的人乳寡糖。因此，探索一种简便、高效、低成本的化学酶法合成LNT系列人乳寡糖的方法，具有重要的研究意义和广阔的应用前景。它不仅能够为婴儿提供更接近母乳营养的人工乳，促进婴儿的健康成长，还能推动相关产业的发展，具有显著的社会效益和经济效益。

1.2国内外研究现状

国外在化学酶法合成LNT系列人乳寡糖的研究方面起步较早，取得了一系列重要成果。BüllC等人在2010年报道了一种高效的化学酶法合成人乳寡糖的方法，通过优化反应条件，提高了产物的收率和纯度。他们的研究为后续的相关研究奠定了基础，引发了众多科研团队对化学酶法合成人乳寡糖的深入探索。此后，许多研究致力于改进反应体系和条件，以实现更高效的合成。例如，一些研究通过筛选和改造酶催化剂，提高了酶的活性和稳定性，从而提高了反应效率；还有研究通过优化底物的选择和配比，进一步提高了产物的产量和质量。

在国内，随着对人乳寡糖研究的重视，化学酶法合成LNT系列人乳寡糖的研究也取得了一定的进展。中国农业大学的江正强教授团队在人乳寡糖的生物制造方面开展了深入研究，已发掘新型α-L-岩藻糖苷酶、β-N-乙酰氨基己糖苷酶、β-半乳糖苷酶等，并定向改造部分酶分子，实现了2′-FL、3-岩藻糖基乳糖（3-FL）、LNnT和LNT等人乳寡糖的酶法制备。同时，他们将新型α-1,2-岩藻糖基转移酶和β-1,4-半乳糖基转移酶引入到大肠杆菌等底盘细胞中，构建高效合成2′-FL、3-FL、乳糖-二岩藻四糖（DFL）、LNT和LNnT的高产工程菌株。这些研究成果为我国人乳寡糖的产业化发展提供了技术支持。

然而，当前化学酶法合成LNT系列人乳寡糖的研究仍存在一些不足之处。一方面，反应体系的优化仍有待进一步深入，虽然已经取得了一些进展，但在提高反应效率、降低成本方面还有很大的提升空间。例如，如何进一步优化酶的用量和活性，以减少酶的使用成本，同时提高反应的转化率，仍然是一个需要解决的问题。另一方面，