苦豆子类生物碱抗乙型肝炎病毒作用及机制研究.pdfVIP

中19药科人学硕卜学位论文一种苦豆子类生物碱抗乙型11炎「病毒作1月及J4机理初探

mlx2,Dig抗体一Ap偶联物441x1,NB7(硝基四氮咪-:)105p1,BCIP(5一嗅-4

一氛一3一1q1噪磷酸)851x1,HBVDNAN日性对照及HBV-DNA阴性对照，)l准膜),I-

色列和硝酸纤维素膜:孔径0.45u)

其它试剂同第一部分1.30

1.4仪器

荧光定量分析仪:PE7700型，关国PerkinElme「公司制造。微缺恒温器:HW-8

型，绍兴市卫星医疗设备制造有限公司制造。HH-S11.4型电热恒温水浴锅:江‘苏沙

洲医疗器械厂生产。高速低温离心机:SORVALL.,Biofugefresco公司产品。TGL-

16G高速冷冻离心机:上海安亭科学仪器厂生产。DG/20-002型台式千燥箱:重庆实

验设备厂制造。FR-200型紫外与可见分析装置:上海复日科技有限公司制造。SHB-111

循环水式多用真空泵:郑州长城科工贸有限公司制造。点样抽滤器:5x8孔，购自复

旦大学医学院预防医学研究所。无DNARNA酶Eppendorf管:Axygen公司产品。

其它同第一部分1.40

2实脸方法

2.1试荆配制

(1)RPMI1640培养液，D-Hanks液，细胞消化液(0.25%胰蛋白酶)，胎牛血清

(FBS)同第一部分2.1。

(2)PBS:NaCl8g,KC10.2g,Na2HP041.44g,KH2PO40.24g于800ml蒸馏水中，调pH

到7.4，定容到I1,高压灭菌20min，室温保存。

(3)细胞裂解液:含50mmol·1-1TrispH8.0;150mmol·1-NaCl;5mmol·1

一，EDTA;取i00mi加lml1%NP-40.

(4)蛋白酶K(Pro.K):终浓度l00ggml-I

(5)TE缓冲液:IOmMTris-HCI(pH8.O)/0.OIMEDTA(pH8.0)

(6)通用裂解缓冲液:25mMTris-CIpH7.9,10mMEDTA,O.1M

NaC1,0.5%SDS,0.5mg·ml-Pro.K

(7)4附谢性Lt肝炎病原基因诊断试剂工作液配制(按照试剂盒的说明书配制)。

2.2细血培养及传代

同第一部分2.2.

2.3对HepG22.2.15细胞的HBVDNA抑制实脸

2.3.1细胞培养以及加药方案

每毫升4x100个HepG22.2.15细胞接种于24孔细胞培养板，每孔0.5m1,并加入0.5

ml无G4181640培养液，370C5%CO2培养24h后取出上清，根据预实验结果，加入

无毒浓度以下三种碱的稀释液0.5ml，并加入无G4181640培养液0.5m1使其终浓度为:

苦参总碱1.0,0.5,0.25.0.025mg-ml-1;氧化苦参碱2,1，0.5mg-ml-1:苦参碱0.5,

中国药科人学硕is学位论文种苦捷r-类生物碱抗乙型肝炎病毒作川及it机理初探

0.25,0.025mg-mls;k襄森幻而5,6.25,1.25,0.25gg-mlo370C5%C02培养，

侮3d收取上清液，换原浓度药液继续培养，共加药培养9天，第9天收集_I.消后裂解细

胞提取细胞内HBVDNA。将收集的培养液-20℃保存，以便测定细胞外HBVDNA.

实验设3-4孔无药物细胞对照，爪义4次。

2.3.2从培养细胞中提取总HBVDNA141

(1)实验结束，保存!:清，将细胞用NIis洗两次，倾去:

(2)加10倍体积(300u1)的细胞裂解液，l0%SDS1/10体积(30u1)，

室温20min;

(3)将细胞转移至1.5mlEppendorf管中，加30“1蛋r!酶K至终浓度100ugrnl

，，混匀，560C水浴4h;

(4)酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混匀，40C12000rpm20min;

(5)取上清。冷无水乙醇1m1,颠倒混匀，-200C沉淀DNA4h;

(6)4C12000rpm离心5min，弃上清;

(7)冷75%乙醇洗涤1次，弃上清，干燥后溶于25u1TE溶液中;

(8)取5111稀释到80111，260nm,280nm测DNA的浓度和纯度:如纯