《边缘无浆体荧光PCR检测方法》.docxVIP

ICS11.220CCSB41

团体标准

T/CVMA353—2026

边缘无浆体荧光PCR检测方法

Real-timePCRmethodfordetectionofAnaplasmamarginalea

2026-3-4发布2026-3-4实施

中国兽医协会发布

T/CVMA353—2026

I

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由河南农业大学提出。

本文件由中国兽医协会归口。

本文件起草单位：河南农业大学、塔里木大学、西北农林科技大学、信阳市畜牧兽医技术服务中心、郑州中道生物技术有限公司。

本文件主要起草人：李俊强、张龙现、王荣军、齐萌、赵光辉、胡建新、任宝红、赵金凤、杜海利、宁长申、菅复春、张素梅、朱子奇、廖培琪、马超锋、李晓迎、毋亚运、李森阳、许会艳。

T/CVMA353—2026

1

边缘无浆体荧光PCR检测方法

1范围

本文件规定了边缘无浆体的荧光定量PCR检测方法及结果判定等操作要求。

本文件适用于边缘无浆体的检测、流行病学调查及检疫。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范兽医学检测

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

BHQ：无荧光淬灭基团（blackholequencher）

BSL：生物安全防护实验室（animalbiosafetylaboratory）

bp：碱基对（basepair）

Ct值：每个管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（cyclethreshold）

ddH2O：双蒸水（double-distilledH2O）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

FAM：6-羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein）

MSP1β：主要表面蛋白1β（majorsurfaceprotein1β)

PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsalinebuffer）

qPCR：荧光定量PCR（fluorescentquantitativePCR）

5主要仪器与设备

5.1荧光定量PCR仪。

5.2微量可调移液器及配套吸头（0.1μL~2.5μL，0.5μL~10μL，10μL~100μL，100μL~1000μL）。

T/CVMA353—2026

2

5.3漩涡振荡器。

5.4台式离心机。

5.5高压蒸汽灭菌器。

5.6生物安全柜或超净台。

6试剂与耗材

6.1除非另有说明，检测中所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682的要求。

6.2血液基因组DNA提取试剂盒（市售产品，可选择同类产品替代）。

6.3qPCR扩增专用酶试剂盒（市售产品，可选择同类产品替代）。

6.4引物和探针。参照边缘无浆体MSP1β蛋白基因位点参考序列（见附录A），设计边缘无浆体荧光PCR扩增特异性引物及探针序列，见附录B。

6.5阳性对照：已经鉴定的边缘无浆体DNA样品。

6.6阴性对照：灭菌双蒸水。

7样品的采集、保存及运送

7.1样品的采集

应按照GB/T27401的相关要求进行采样。具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员操作，确定采血部位，针对家畜类动物，在颈静脉或尾静脉处，使用无菌采血器具和抗凝真空采血管（含EDTA）采集约3mL血液，采血前后进行局部消毒，采血过程中应避免样本交叉污染。每份样本应标记编号、动物种类、年龄、品种、采样时间、采集地点等信息。

7.2样本的保存与运输

采集的血液样品，在2℃~8℃的条件下保存应不超过24h，长期保存需置于-20℃冻存。

长距离运输的样品应先置于密封不透水、防泄漏容器内，再将容器放入具有防压、不透水及防泄漏功能的辅助包装中，最后在周围放置医用