《毕氏肠微孢子虫PCR检测方法》.docxVIP

ICS11.220CCSB41

团体标准

T/CVMA352—2026

毕氏肠微孢子虫PCR检测方法

PCRmethodfordetectionofEnterocytozoonbieneusi

2026-3-4发布2026-3-4实施

中国兽医协会发布

T/CVMA352—2026

I

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由河南农业大学提出。

本文件由中国兽医协会归口。

本文件起草单位：河南农业大学、塔里木大学、西北农林科技大学、信阳市畜牧兽医技术服务中心。

本文件主要起草人：李俊强、王荣军、张龙现、齐萌、赵光辉、胡建新、卢基忠、马超锋、赵金凤、菅复春、张素梅、朱星宇、魏一卓、李晓迎、毋亚运、余复昌、李森阳、杜海利、许会艳。

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毕氏肠微孢子虫PCR检测方法

1范围

本文件规定了毕氏肠微孢子虫PCR检测方法的材料、操作步骤和结果判定。

本文件适用于动物粪便样品中毕氏肠微孢子虫核酸的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范兽医学检测

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

BSL：生物安全防护实验室（biosafetylaboratory）

bp：碱基对（basepair）

ddH2O：双蒸水（double-distilledH2O）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）

ITS：内转录间隔区（internaltranscribedspacer）

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液（trisaectate-EDTAbuffer）

rTaq酶：rTaqDNA聚合酶（rTaqDNApolymerase）

5主要仪器与设备

5.1PCR扩增仪。

5.2漩涡振荡器。

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5.3台式离心机。

5.4微量可调移液器及配套吸头（1μL~2.5μL，0.5μL~10μL，10μL~100μL，100μL~1000μL）。

5.5核酸电泳仪。

5.6核酸电泳槽。

5.7凝胶成像分析系统。

5.8高压蒸汽灭菌器。

5.9生物安全柜或超净台。

6试剂与耗材

6.1一次性密封袋。

6.2EP离心管（1.5mL）。

6.32.5%重铬酸钾溶液，按照附录A中A.1规定的方法配制。

6.4粪便基因组DNA提取试剂盒（市售产品，可选择同类产品替代）。

6.5PCR管（200μL）。

6.6PCR扩增试剂盒（市售产品，可选择同类产品替代）。

6.71×TAE缓冲液，按照附录A.2和附录A.3规定的方法配制。

6.8安全无毒核酸染料。

6.9配置试剂用水采用蒸馏水或去离子水，PCR用水按照GB/T6682中一级水的规定执行。

6.10巢式PCR引物。参照毕氏肠微孢子虫rRNA基因ITS位点参考序列（见附录B），设计巢氏PCR扩增特异性引物序列，见附录C中表C.1。

6.11DNA标准分子质量。

6.121%琼脂糖凝胶，按照附录A.4规定的方法配制。

6.13阳性对照：已经鉴定的毕氏肠微孢子虫DNA样品。

6.14阴性对照：灭菌双蒸水。

7样品的采集、保存及运送

7.1样品的采集

应按照GB/T27401的相关要求进行采样。具有掌握相关专业知识和操作技能的工作人员操作，在采集畜禽动物新鲜粪便样本时，对于禽类，可采用棉拭子从其泄殖腔取样；对于哺乳动物，可从直肠进行取样约10g