干扰素的工艺制备流程.pptVIP

基因工程药物

--干扰素的制备

;1什么是干扰素;1.1天然干扰素的分类;提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力

增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性

抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答

趋化作用

抗病毒和抗肿瘤作用〔次要〕

2.根据动物来源确定分类

人干扰素〔HuIFN〕，小鼠干扰素〔MuIFN〕。

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不同来源的干扰素;1.2重组干扰素的临床应用;2基因工程大肠杆菌发酵生产工艺;干扰素生产工艺路线;目的基因的别离;一、目的基因的别离与扩增;二、构建重组质粒;三、重组体引入宿主细胞;四、受体菌的筛选;五、分析保存;干扰素的发酵工艺过程;1．菌种培养取－70℃下保存的甘油管菌种〔工作种子批〕，于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度30℃，pH7.0，250r/min活化培养18±2小时后，进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。

2．种子罐培养将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂菌;3.发酵罐培养将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温度20℃，pH6.0，溶解氧60%，继续培养5～6.5小时。同时进行发酵液杂菌检查，当OD值达9.0±1.0后，用5℃冷却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中，参加冰块使温度迅速降至10℃以下。

4.菌体收集将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体枯燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等工程的检测。菌体于－20℃冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个月，检查一次活性。;3.干扰素的别离纯化工艺过程;3.1干扰素别离工艺过程;(1)菌体裂解

;(2)预处理-沉淀;(3)离心

;〔4〕初级别离

;3.2、干扰素纯化工艺过程;(1)溶解粗干扰素

;(2)沉淀与疏水层析

;等电点沉淀〔2〕：磷酸调???pH4.5，调节电导值40ms/cm，2℃～10℃，静置过夜

超滤：1000ku超滤膜过滤，除去大蛋白。

透析除盐：调整溶液pH8.0，电导值，10ku超滤膜，0.005M缓冲液。;(3)无菌过滤分装;(4)检测工程

;半成品检定;〔5〕相对分子量测定

复原型SDS，加样量不地域微克，同时用相对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比较，误差不得高于10%。

〔6〕剩余外源性DNA含量测定

用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中剩余外源性DNA应低于100pg。

〔7〕剩余血清IgG含量测定

在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项检定。

〔8〕剩余抗生素活性测定

半成品中不应有抗生素活性存在。;

〔9〕紫外光谱扫描

检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在280±2纳米。

〔10〕肽图测定

用CNBr裂解法，测定结果应符合干扰素的结构，且批与批之间应一致。

〔11〕等电点测定等电聚焦电泳。

〔12〕除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质试验。;成品检定;〔5〕热原质试验

同半成品检定。

〔6〕干扰素效价测定

同半成品检定，效价不应低于标示量。

〔7〕平安试验

取体重为350-400克豚鼠3只，每只腹侧皮下注射量为成人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，假设豚鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，说明成品合格。

取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，假设动物全部存活，说明成品合格。;4国内基因工程药物产业开展状况;存在的问题：

〔1〕同种产品生产厂家过多，造成市场恶性竞争，严重影响产业的健康开展。

〔2〕融资渠道单一、产业开展资金缺乏。

〔3〕医药市场竞争无序，行业不正之风严重。

〔4〕企业管理相对滞后，技术兼经营型人才匮乏。;谢谢！