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生物技术研发与产业化应用手册

第1章生物技术研发基础与前沿

1.1分子生物学核心技术与测序应用

聚合酶链式反应（PCR）是分子生物学的基石，其核心原理是利用DNA复制机制通过高温变性、低温复性、高温退火循环来扩增目标序列。在实验操作中，需先设计引物，确保其与目标基因两端互补，且Tm值在55-65℃之间以保证特异性扩增；以人类白细胞抗原（HLA）基因片段为例，通过30个循环的PCR反应，理论上可将每个原始基因拷贝数扩增至$2^{30}$倍（约109亿倍），足以满足临床检测需求。实时荧光定量PCR（qPCR）技术通过监测扩增过程中荧光信号的强度变化来实时计算目标基因的相对或绝对表达量，其计算公式为$Ct$值（Cyclethreshold）与基因拷贝数呈负相关，即$Ct$值每降低1个循环，拷贝数理论上增加2倍；在肿瘤异质性研究中，利用qPCR可精确区分不同亚克隆的癌细胞表达差异，例如在乳腺癌细胞系中，可定量分析HER2蛋白在肿瘤细胞与正常成纤维细胞间的表达比率，通常肿瘤细胞HER2水平可达正常细胞的100-1000倍。

下一代测序（NGS）技术通过双联发测序仪在微珠上并行读取数百万条DNA片段，其核心优势在于高通量与低成本，一次运行即可覆盖长达100万碱基对的基因组；在临床肿瘤基因组学中，利用NGS技