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2025年基因工程与细胞培养技术手册

第1章

1.1限制性内切酶与连接酶原理应用

限制性内切酶（RestrictionEndonucleases）是基因工程中“分子剪刀”的核心，根据来源可分为TypeI、TypeII和TypeIII家族。TypeII酶最为常用，如EcoRI（EcoRI）、HindIII（HindIII）和BamHI（BamHI）。当酶切位点位于DNA双链的特定位置时，酶会在磷酸二酯键处切断磷酸基团，产生5-磷酸、3-羟基末端（粘性末端）或平末端。例如，EcoRI识别序列为GAATTC，切割后产生5-G和3-A的突出端，长度为4个碱基。连接酶（Ligase）作为“分子胶水”，负责将两个DNA片段连接起来。常用的T4DNA连接酶（T4Ligase）可在无ATP存在的条件下，利用ATP水解产生的能量催化3-OH与5-磷酸基团形成磷酸二酯键，实现平末端或粘性末端的连接。其催化效率受双链DNA浓度、酶量及温度（通常为16℃）影响显著，且连接酶对末端结构有偏好，粘性末端连接效率通常远高于平末端。

在构建重组质粒时，首先需对供体DNA和载体DNA分别进行酶切。若两者产生相同类型的粘性末端，可直接使用T4DNA连接酶进行连接，无需额外能量来源；若产生平末端或不同粘性末端，必须使