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农杆菌介导转化实验报告

一、实验材料与试剂准备

（一）植物材料

本实验选取烟草（NicotianatabacumL.cv.NC89）无菌苗作为转化受体材料。烟草种子经70%乙醇消毒30秒，再用0.1%氯化汞溶液消毒8分钟，无菌水冲洗5-6次后，接种于MS固体培养基（不含植物生长调节剂）上，在25℃、光照强度1500-2000lx、光照时间16小时/天的培养条件下培养。待幼苗长至4-6片真叶时，选取生长健壮、无病虫害的叶片作为外植体，用无菌手术刀将叶片切成0.5cm×0.5cm的小块，备用。

（二）菌株与载体

实验所用农杆菌菌株为LBA4404，携带双元表达载体pBI121。该载体含有CaMV35S启动子驱动的β-葡萄糖苷酸酶（GUS）报告基因和新霉素磷酸转移酶（NPTⅡ）筛选标记基因。农杆菌菌株在含有50mg/L卡那霉素（Kan）和50mg/L利福平（Rif）的YEB固体培养基上28℃黑暗培养2天，挑取单菌落接种于含有相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养至OD???值为0.5-0.6，备用。

（三）培养基与试剂

MS基本培养基：按照Murashige和Skoog（1962）的配方配制，包含大量元素、微量元素、铁盐、有机成分，pH值调至5.8-6.0，加入0.8%琼脂粉，121℃高压灭菌20分钟。

共培养培养基：MS培养基中添加1.0mg