增分微专题❷　基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建.docxVIP

增分微专题?基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建

[真题示例]

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)(2025·山东卷)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。

(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为________________。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切，再选择SmaⅠ和________对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端补平，补平时使用的酶是____________。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶________________进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较短的条带长度近似为________bp，则一定为正向重组质粒。

(2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为______(填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶，且T-DNA中应