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第七节 分子杂交技术 杂交的基本原理 杂交的基本方法 探针的标记 第一节 核酸分子杂交的基本原理 核酸分子杂交的基本原理：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。 探针 一、DNA变性与复性 1.DNA变性 ①定义：氢键断裂，单链 ②方法:热变性: 90~100℃ 熔解温度(Tm) 酸碱变性:常采用碱变性 化学试剂变性;尿素、甲醛等 2.DNA复性(退火) DNA/DNA，DNA/RNA，RNA/RNA 二、影响杂交的因素 1.核酸分子的浓度、长度和复杂性 2.离子强度 3.温度 4.杂交促进剂：硫酸葡聚糖等 5.非特异性杂交反应 预杂交：用鲑鱼精子DNA封闭非特异性杂交位点 第二节 分子杂交的基本方法 Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交 一、Southern blotting 1975年，英国Edwen Southern创建 检测DNA杂交方法，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 应用：基因组DNA的定性和定量分析 基因诊断、分子克隆、法医学等 Southern bloting的主要步骤 1.待测DNA样品的制备、酶切 2.待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜(印迹)： 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测 核酸的分子杂交 将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。 1.待测DNA样品的制备、酶切 DNA的提取原理：裂解细胞，使DNA释放，用TE液溶解，交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质 标准程序：酚——酚-氯仿——氯仿。 2.待测DNA 样品的电泳分离： 琼脂糖凝胶电泳 3.凝胶中DNA的变性：碱变性 4.Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 5.Southern杂交(预杂交、杂交、洗膜) 6.杂交结果的检测 二、Northern 印迹杂交(Northern bloting) 检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA，不需用限制酶消化 RNA电泳 转膜：电泳结束后不需变性 应用：检测外源基因在宿主中能否转录 RNA提取 1.样品细胞的有效破碎 2.使核蛋白复合体变性 3.对内源RNA酶的有效抑制 4.有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离 三、斑点印迹杂交(dot bloting) 将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上 优点：简单、快速、可同时检测多个样品 应用：确定DNA样品之间的同源性 四、核酸原位杂交(in situ hybridization) 1.定义：将标记的探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交检测的方法。 2.特点： 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态 核酸原位杂交的基本步骤 1.细胞或组织的固定：载玻片 2.组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质 3.探针的选择和标记 4.杂交 5.杂交结果检测 1.荧光染色体原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization；FISH) 基本原理是将DNA探针用荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体上，来检测DNA序列在染色体上的定位。 2.多色荧光染色体原位杂交(multicolor FISH; mFISH ) 3.比较基因组原位杂交(Comparative Genomic Hybridization；CGH ) 3.比较基因组原位杂交(Comparative Genomic Hybridization；CGH ) 利用两种不同的荧光分別标记两种不同細胞的Genomic DNA ，再同时与正常的染色体进行hybridization，染色体上不同荧光间的强弱比值，由此比较而观察基因组中特定基因的拷贝数变化。 CGH主要用于检测肿瘤组织DNA拷贝数变化（缺失、复制、扩增），并能将这些异常在染色体上定位。该方法通过同一次实验即可扫描整个肿瘤基因组DNA序列的增加或丢失。 五、 Western 印迹法(Western bloting) 检测蛋白质，即将电泳分离的蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质