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组织总RNA抽提 交大医学院检验系生化教研室 陈 宁 RNA简介 RNA 腺嘌呤（A） 尿嘧啶（U） 胞嘧啶（C） 鸟嘌呤（G） 四种核苷酸串联组成的单链。 RNA的主要类型有三种： 信使RNA（mRNA） 转录DNA上的遗传信息 核糖体RNA（rRNA） 与蛋白质结合形成核糖体，形成细胞内蛋白质合成的场所 转移RNA（tRNA） 运输被激活的氨基酸，翻译mRNA上的氨基酸序列 mRNA与蛋白质的表达具有关联性。 控制生物性状的基本单位是基因，而生物性状的表达则主要通过蛋白质。 研究发现，所有基因均先转录成mRNA，再翻译成蛋白质。 与RNA有关的研究方法 RT-PCR mRNA通过RT-PCR（逆转录-PCR），可建立相应cDNA文库 RNA序列分析 潜在基因分析 Northern 杂交 用于真核细胞中RNA表达和大小的检测分析（RNA-DNA探针） RNA干扰技术（RNAi） 通过双链小干扰RNA（siRNA）的形成，诱导同源mRNA降解 组织RNA的抽提和纯化 RNA质量的标准 完整性 — 避免外源性及内源性RNase对RNA的降解 均一性 — 有效去除抽提过程中残留的DNA、蛋白质和有机溶剂 组织RNA抽提纯化方法 TRIzol试剂抽提法 利用含异硫氰酸胍成分的TRIzol破碎组织细胞，并抑制细胞释放的核酸酶。 硅胶膜纯化柱抽提法 硅胶膜纯化柱能迅速特异地吸附样品裂解液中的RNA，无需酚氯仿抽提，不用乙醇等沉淀，只须不断洗脱即可得到高纯度的RNA。 组织应先用生理盐水冲洗，去除残留的血液，用剪刀等切成小块 TRIzol试剂 常用总RNA抽提试剂 苯酚：裂解细胞，有效变性蛋白质。 异硫氰酸胍： 解偶剂，强力蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。同时，异硫氰酸胍也是常用RNA抑制剂，可使RNase失活。  离心之后，样本一般分为水样层、中间层和有机层。 RNA存在于水样层中。 ** 在除去水样层后，亦可用沉淀法来逐步分离样品中的DNA和蛋白质。如：乙醇沉淀中间层的DNA；在有机层中加入异丙醇，沉淀蛋白。 俗称IPA，是正丙醇（CH3CH2CH2OH）的同分异构体。 在抽提过程中进一步溶解样本中的蛋白质，沉淀RNA，起到纯化作用。 静置主要为了提高沉淀效率。 离心前RNA沉淀通常不可见。 再次离心后，样本中的RNA将会沉积于管壁或管底部。 上清液中为异丙醇、残余蛋白质。所以尽可能去除上清液。 主要用于RNA的洗涤，去除实验前的金属盐，而RNA自身不溶于乙醇。 混匀时，应尽量使沉淀悬浮于溶液中。 RNA纯度 RNA含量 注意事项 样本选择 * 血液样本，应为新鲜血液，不得超过4小时的放置。如需过后处理，应先加入TRIzol试剂，置于-80℃保存。 ** 组织样本，应取动植物生长旺盛的部分，如：动物的肝组织，植物的幼芽。 *** 细胞样本，应选择处于生长旺盛期的细胞。 注意事项 DEPC是RNase的化学修饰剂，可与RNase的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。所以DEPC是活性很强的剧毒物，须在通风柜中小心使用。 DEPC能与腺嘌呤作用，从而破坏mRNA活性。 配制含DEPC成分的试剂时，应在加入DEPC后剧烈振荡10min，再高压灭菌以消除残存的DEPC。 DEPC能与胺、巯基反应，故含Tris及DTT的试剂不可加入DEPC。 注意事项 RNase污染的主要来源 实验操作者手指、唾液 Tip 头 水/缓冲液 阳离子（Ca+、Mg2+） 其他实验（eg:质粒抽提）影响 后续实验所用酶 …… 注意事项 杜绝RNase污染 （1）避免外源性RNase的污染 * 实验中佩戴口罩和手套； ** 涉及的实验器具设备应彻底处理； *** 试剂及使用的溶液必须为RNase-Free，其中，水必须处理，多用0.1%DEPC-H2O。 （2）消除内源性RNase 选择合适的匀浆方法和裂解液，合理控制样本量。 常见问题分析 提取RNA量较少 ? 样本裂解或匀浆处理不彻底，RNA没有被完全释放出来 ? 定量检测时RNA沉淀未完全溶解 常见问题分析 RNA样品的A260/A280值小于1.6 ? 检测吸光度时，RNA应用DEPC-H2O溶解，不用TE。低离子浓度和低pH条件下，A280值会偏高。 ? 制备匀浆时，Trizol试剂量过