学生课件 考马斯亮兰法测定蛋白质含量.pptVIP

考马斯亮兰法测定蛋白质含量 七年制200603班孙敏 实验目的 学习掌握考马斯亮兰染料结合法测定蛋白质浓度的基本原理。 了解考马斯亮兰法测定蛋白质含量的优缺点。 实验原理 考马斯亮兰G-250染料在酸性条件下能与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰值从465nm变成595nm，溶液的颜色由棕红色变为蓝色，在595nm测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比，故可用于蛋白质定量测定。 此实验的灵敏范围 微量法测定蛋白含量范围为1μg-10μg；常量法则以检测范围10μg-100μg为宜。 此方法的优缺点 （1）灵敏度高，最低检测量可达1?g，是 目前灵敏度最高的蛋白质测定法。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。 （3）干扰物质少 Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差 当样品中存在大量去垢剂时，显色反应会受到干扰。 标准曲线有轻微的非较线性 实验器材与试剂 （1）玻璃仪器：试管15支，吸管5ml、0.5ml各1支、0.1ml 3支（吸标准溶液的一支吸管从低浓度向高浓度吸）。 （2）721分光光度计。 实验试剂 1）9g/L NaCl溶液。 （2）标准蛋白质溶液（lmg／ml）。 （3）待测血清：取血清0.25ml，置于50ml容量瓶中，加生理盐水至刻度，摇匀。样品稀释200倍。 （4）考马斯亮兰G250染液：称取考马斯亮兰G250 0.1g，溶于950g/L乙醇0.5 m1中，再加入850g/L磷酸100m1，加蒸馏水至1000ml。 步骤1．标准曲线制备 取试管13只，按下表编号。将lmg／ml的标准蛋白溶液配制为1000μg／ml，500μg／ml， 250μg／ml，125μg／ml ，62.5μg／ml和31.25μg／ml的系列稀释液，按下表操作并记录： 考马斯亮兰法测定蛋白质含量 摇匀，室温静置3min。以空白管调零，在波长595nm比色，读取各管的光吸收值。以各标准管蛋白质含量(μg)为横座标，各管光吸收值为纵座标作图，绘制标准曲线。 步骤2．未知样品测定 取试管2只，按上表测定管操作，摇匀，静置3分钟，在波长595nm读取光吸收值。用2管的平均光吸收值在标准曲线上查出相应的蛋白质含量，按以下公式计算出该样品的蛋白质浓度（g/L）。 未知蛋白质浓度计算 未知样品蛋白质浓度(g/L)＝标准曲线查得蛋白质浓度 × 稀释倍数 × 单位换算 注意事项 1．不可使用石英比色皿（因不易洗去染色）。塑料或玻璃比色皿使用后立即用少量95%乙醇洗去染色，防止读数误差。 2．塑料比色皿绝不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 * * 目的？ 是微量的才能测哦！ 优点 缺点 量 光吸收值 (λ=595nm) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 考马斯亮兰染液 0.1 — — — — — — — 稀释血清样品 — — — — — — — 0.1 生理盐水 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 — 标准蛋白质溶液（lmg／ml） 6×2 5×2 4×2 3×2 2×2 1×2 测定管 ×2 标准管 空白管 管号 试剂(ml) 让我告诉你怎么算吧