单克隆抗体-面试.pptVIP

单克隆抗体理论依据 一个B淋巴细胞只能识别抗原的一个表位，所以只能产生针对该表位的特异性抗体。 若能把此 B 细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可得单一种类的抗体，只会对一种抗原决定基反应，其专一性极高。B 细胞特点：不易体外生长，寿命短,分泌特异系性抗体 癌（瘤）细胞的生长不受控制，很容易在培养基中生长，有很多已经建立好的癌细胞株，其生长特性均已了解。骨髓瘤细胞特点：寿命长 单克隆抗体理论依据 利用癌细胞永续生长的特性和融合法，把癌细胞导入可生产有用抗体的 B 细胞中，则可在培养基中永久生长的 B 细胞株，此即杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞特点：寿命长，可产生单克隆抗体 单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。杂交瘤技术 杂交瘤技术 细胞融合细胞选择 髓瘤细胞的选择骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞，目前建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子。 SP2/0-Ag14的选择优点：1、丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，便于HAT（A氨基喋呤是叶酸的类似物）培养基的筛选未融合的细胞。2、可在8－氮杂鸟嘌呤（嘌呤核苷酸代谢类似物）培养基中生长，便于筛选“返祖”的HGPRT+ 细胞。 脾淋巴细胞的准备取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。取脾脏，收获脾细胞悬液，通常每只小鼠可得1×108-2.5×108个脾细胞，每只大鼠脾脏可得5×108-10×108脾细胞。 饲养细胞的制备在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞。它促进其他细胞增殖的机制尚不明了，一般认为它们可能释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件；也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。 单抗检测 时间：融合后2周左右 检测方法特点 抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力 常用检测方法 酶联免疫吸附试验、放射免疫检测 杂交瘤细胞的克隆化 所谓克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团体的整个培养过程。 克隆化的原因 从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞，可能来源于二个或多个杂交瘤细胞，因此它们所分泌的抗体是不同质的。为了得到完全同质的单克隆抗体，必须对杂交瘤细胞进行克隆化。 杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的，有的细胞丢失部分染色体，可能丧失产生抗体的能力。为了除去这部分已不再分泌抗体的细胞，得到分泌抗体稳定的单克隆杂交瘤细胞系（又称亚克隆），需要克隆化。 长期液氮冻存的杂交瘤细胞，复苏后其分泌抗体的功能仍有可能丢失，因此也应作克隆化，以检测抗体分泌情况。 杂交瘤细胞的克隆化原因 杂交瘤细胞的克隆化方法 克隆化的方法很多，如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪（FACS）分离法。 限稀释法、软琼脂法最常用的两种方法。 有限稀释法 软琼脂法 * * 生物制品 生物制品：利用微生物、寄生虫及其组织成分或代谢产物以及动物或人的血液与组织液等生物材料，通过生物学、生物化学以及生物工程学的方法制成的，用于传染病或其他疾病的预防、诊断和治疗的生物制剂 应用于临床诊断和治疗 杂交瘤技术原理： 聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细?胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤?细胞系 单克隆抗体生成：接种杂交瘤?细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体 流 程 单克隆抗体制备：杂交瘤技术 一、动物免疫 免疫抗原制备 （免疫抗原是越纯越好）。 免疫动物的选择根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。 免疫程序的确定 HAT培养基： H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA HAT选择作用： 淋巴细胞：不能生长，5~7