耐高渗透压产谷氨酸菌的选育.doc

【标题】耐高渗透压产谷氨酸菌的选育 【作者】董 佳 【关键词】高渗透压??谷氨酸菌??紫外诱变??选育 【指导老师】王 庆 【专业】生物科学 【正文】1?引言1866年德国的H.Ritthausen博士首次利用硫酸水解小麦面筋，分离得到谷基酸。之后1957年木下等人创产发酵法生产谷氨酸，迄今已有50年的历史；经各国科学家的不懈努力，在全世界已建立了完整的谷氨酸生产体系。自从1956年日本协和发酵公司木下视郎首先分离选育出谷氨酸棒杆菌以后，由于可以在不改变现有生产设备的情况下，通过改变微生物菌种挑选出具有活力强、发酵周期短、产酸，转化率高等特性的优良菌株来大幅度提高谷氨酸的产量和质量[1]。一直以来各国科学家都致力于选育更优良的生产菌，因此优良生产菌种的选育一直是谷氨酸发酵的主要研究课题。我国从1958年开始筛选谷氨酸生产菌，1964年在上海投入工业化生产。经过我国科技工作者不断努力，先后分离选育出的谷氨酸生产菌种有在北京淀粉厂筛选出的北京棒杆菌、在天津筛选出的天津棒杆菌、在广州筛选出的钝齿棒杆菌及它们的诱变菌株。我国虽在谷氨酸生产菌选育工作方面有一定成效，但从自然界中分离得到的菌属少，只有棒杆菌属和短杆菌属两个属，还没有小杆属和节杆属菌，株数量也只有少量的几十种，而比起日本多达近千种的谷氨酸生产菌株，我国生产菌资源还相当贫乏，这已经成为我国提高味精工业经济效益、降低成本的“瓶颈”[2]。所以我国科技工作者不断进行大量菌种选育工作，谷氨酸生产菌种的选育方法基本分为二种，一种是常规的育种方法，另一种是采用遗传工程选育新菌种，后者包括原生质体融合技术和基因工程技术[3]。沈艺文，郭永红曾经对高糖平板、高谷氨酸平板在谷氨酸生产菌种复壮中的应用进行过研究，利用菌株的自身代谢物和高浓度糖的培养基筛选优良菌株[4]。黎剑雄，黄小升，卢超华等人采用天津短杆菌T6—3突变株328#，进行分纯，经初筛和三次复筛，测定一级种各项指标、镜检杂菌、噬菌体检查，挑出活力强，产酸高的菌株[5]。陈碧娥,王丽娜以北京棒杆菌Q-72为出发菌株，经紫外线诱变，筛选能在以琥珀酸为唯一碳源的培养基上生长良好的菌株，强化CO2固定反应．突变株UH62的产酸率和转化率分别比出发菌株提高1.45％和9.1％?[5]。周盛，李家洲，武波经化学诱变，通过改变谷氨酸棒杆菌B1的代谢途径筛选出以甘油，琥珀酰CoA和乙醛酸为碳源的营养缺陷型，该突变菌株B4的产酸率和转化率分别比出发菌株高18.1％和12.7％[7]。利用原生质体融合技术进行选育的是陈宁，张克旭。他们采用黄色短杆菌Tl为始发菌株，根据代谢控制发酵原理，利用紫外线、硫酸二乙脂进行诱变，定向选育出具有寡霉素抗性、谷氨酸氧肟酸盐抗性的温度敏感突变株TM。然后，以温度敏感突变株TM和产酸率高(10.5%以上)的天津短杆TG961为亲株。通过原生质体融合技术，成功地选育出了产酸率高的融合子CM021，并且该菌株系温度敏感型菌株，可用于谷氨酸强制发酵[8]。利用基因工程技术选育的有周盛，武波和李家洲，他们从大肠杆菌K-12中通过PCR扩增出磷酸果糖激活编码基因(pfkA?)，将其与表达载体pCMVTNTTMvector连接构建成重组质粒pKu- 1，转化谷氨酸棒杆菌B4；选育出产酸高的优良菌种，把谷氨酸生产菌的选育提升到分子水平[9]。由于我国从自然界分离得到的菌株少，品种单一，所建立的谷氨酸生产菌基因库不完善，进而制约着基因工程技术，使其进展缓慢[10]。因此，十分有必要进行自然界谷氨酸的选育工作。本课题选择耐高渗透压产谷氨酸菌种的选育进行初步选育研究，此项研究是首次在涪陵地区对耐高渗透压产谷氨酸菌进行选育。2?材料2.1?样品采集以食品厂及食堂附近没有阳光直射的土壤为实验材料，每个地点采集三个土壤样品。涪陵沙溪沟“宏吉肉类食品有限公司”下水道出水口旁，采集土壤样品三个；长江师范学院李渡校区北苑食堂下水道出水口旁，采集土壤样品三个；重庆市涪陵榨菜（集团）有限公司李渡榨菜厂下水道出水口旁，采集土壤样品三个；重庆市涪陵李渡淀粉厂下水道出水口旁，采集土壤样品三个；重庆市德丰食品有限公司下水道出水口旁，采集土壤样品三个；重庆市涪陵北拱粉条厂下水道出水口旁，采集土壤样品三个。2.2?主要仪器表2.1?实验主要仪器一览表仪器名称 型号 生产厂家双层特大容量全温度恒温培养振荡器 ZSD-1090 上海智城分析仪器制造有限公司电冰箱 BCD—218 中意集团股份公司电热鼓风干燥箱 CS101—2EBN 重庆恒达仪器厂电子天平 MP5002 上海恒平科学仪器有限公司生化培养箱 ZSD-1090 上海智城分析仪器制造有限公司电子分析天平 AR2140 梅特勒—托利多仪器（上海