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谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究 实验内容: (一)亲和层析法制备谷胱甘肽转硫酶 (二)测定酶活力、米氏常数和最大反应速度 (三)Folin-酚法测定蛋白质含量,计算比活力 (一)测定酶活力的原理 (二)测定Km 和V的原理 Km和最大反应速度是酶的特征常数,不同的酶Km和 V不同,受底物、pH、温度、离子强度等因素的影响。将米氏方程的形式加以改变,可以得到几种方程形式,在特定条件下测得不同底物浓度[S]时相应的初速度v,用作图法测定Km和V。米氏方程是从单底物酶促反应推导出来的,但实际上这种反应很少。在多底物反应中,如果只有一种底物浓度发生变化,其他底物浓度保持不变,那么就可以将它看成单底物反应,利用米氏方程的几种形式测定Km和V值。 本实验采用终止法,即在酶和底物反应达到预定的时间(1min)时,立即加入强酸终止酶促反应,在这段反应时间里产物的生成量基本呈线性增加,用这段反应时间内的平均速度代替反应初速度,利用作图法,可以很方便地求出Km和V。 操作步骤 实验用具(一组): · 加样器(200μL):CDNB、GSH(60mmol/L)、酶 · 1mL注射器(塑料):TCA (测定Km和V 时使用) · 比色杯:2个 · 秒表:1块(测定Km和V 时使用)? 试剂(一台): · PB:40m L · CDNB、GSH(60mmol/L)、TCA:小离心管 · GSH(2mmol/L):10m L 调整分光光度计的参数: · wavelength:338nm · delay time:30秒 · cycles:8 (一)酶活力的测定 室温条件下测定,调好紫外分光光度计,取两个比色杯,按下表加样: 测定步骤 1.两个比色杯分别加入PB 、底物CDNB和GSH(60mmol/L),混匀; 2. 放在分光光度计中的空白和“1”位上,注意光路方向,按“zero base”,等待仪器校零; 3. 将“1”位上的比色杯拿出,加入酶的同时按“run”,立即混匀,放入分光光度计中; 4. 仪器自动读8个数(30s读一次),共反应4min。 注意事项 1. 酶液的稀释:取部分酶液用PB稀释5~10倍,混匀。 2. 磷酸缓冲液:加入PB的量与酶量有关,要求终体积为3mL。 3. 加酶量:要求ΔA340nm/min(第二个数)在0.2~0.5之间,否则需要调整加酶量重新测定。 4. 空白:第二组或重做时,空白比色杯不动,只需将“1”位上比色杯重新测定。 5. 重做:只需将“1”位比色杯洗净,加入缓冲液和底物,混匀,校零,加酶,“run”,混匀,测定。 数据处理 (二)Km和V的测定 取六支试管,按下表加样: 测定步骤 1. 每根试管加入CDNB、GSH(2mmol/L)、PB后,加入酶,同时用秒表计时,立即混匀,静置,1分钟时加入50%的TCA,混匀,终止反应; 2. 将仪器 delay time调为0,cycles调为1,空白同酶活性测定,用0试管溶液放在“1”位上校零,测定其他各管的吸光值。 注意事项 1. 酶液的稀释: 酶的稀释倍数与酶活力测定一致 。 2. 磷酸缓冲液:加入PB的量与酶量有关,要求终体积为3mL。 3. 加酶量:根据前面酶活力的测定决定加酶量,使ΔA340nm/min在0.05~0.5之间。 4. 仪器参数调整:将delay time调为0,cycles调为1。 5. 空白:测定酶活力的空白比色杯不动,只需将“1”位比色杯加入0试管的溶液校零,然后依次测定1—5试管中溶液的吸光值。 数据处理 计算出各种作图法需要的数据,用几种直线方法作图,根据横、纵截距求出米氏常数和最大反应速度。 [S] = [GSH](3mL反应体系中的底物浓度) 1/[S] = 1/ [GSH] v = ε / ΔA340nm [S]/v = [GSH]/v * * 酶促反应速度:酶促反应体系复杂,影响酶促反应速度的因素很多,包括底物浓度、酶浓度、产物浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等影响因素。酶促反应速度通常用在一定条件下,以单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示,用产物浓度对反应时间作图,得到酶促反应速度曲线。 从图中可以看到,反应速度只在最初一段时
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