芋头多酚氧化酶的研究.docVIP

【标题】芋头多酚氧化酶的研究 【作者】严德兵 【关键词】芋头??多酚氧化酶??动力学??迟滞性??邻苯三酚 【指导老师】何士敏 【专业】生物 【正文】前??言多酚氧化酶(Polyphenol oxidase PPO)?是植物体内普遍存在的一类铜结合酶。能催化多酚类氧化成醌类。醌再聚合成有色物质，从而引起植物的褐变。酶促褐变与果蔬加工、组培成功以及植物的抗病性等密切相关，因此对于多酚氧化酶的研究有重要的实用价值[1]。芋头(Colocasia esculenta(L.)Schott)，又称芋艿，属天南星科多年生草本植物，作一年生栽培。主产区在非洲、亚洲的中国、日本等。芋头具有丰富的营养成分和疗效成分，口感滑爽，香气普遍受欢迎，风味独特。芋头表皮带毛难以清除，人接触后易导致皮肤瘙痒，给家庭食用带来了不便，宜集中处理后制成鲜切产品销售。目前对鲜切芋艿的研究还相对缺乏，制约了其产业化发展[2]。?关于芋头多酚氧化酶的研究目前国内外很少有报道。本次研究，旨在揭示芋头多酚氧化酶的生理功能以及影响因素，从而为芋头的种植和加工提供科学的依据。1?材料与方法1.1材料???重庆涪陵市售芋头（子芋）1.2方法1.2.1? PPO粗酶液的提取???新鲜芋头洗净、去皮、擦干。称取5g放入研钵，加入15mL pH 7.6的磷酸缓冲液，加少许石英砂，冰浴研磨。然后用磷酸缓冲液定容至100mL。转入离心管，6000r/min离心15分钟。取其上清液即为粗酶液[3]。水提取粗酶的制备是用15mL蒸馏水代替15mL pH 7.6的磷酸缓冲液。1.2.2??测定波长的选择???取0.2mol/L pH=6.8的磷酸缓冲液1ml 0.2mol/L的邻苯二酚溶液1mL，迅速加入粗酶液0.5mL。室温迅速混合均匀后在波长350－520nm（波长间隔10nm）分别测定吸光值随时间的变化。以1.2.3的方法测其活性。1.2.3? PPO活性的测定???先将1mL 0.2mol/L的邻苯二酚溶液加入1cm厚度的玻璃比色皿。再将2mL粗酶液加入到4ml 0.2mol/L pH 7.6的磷酸缓冲液中混合，然后取出1.5mL迅速注入到已加了邻苯二酚的比色皿中（余下的4.5mL重复同样的实验）室温（约20℃左右）下波长为410nm处测定吸光值，蒸馏水作为空白对照。加入酶液后开始计时,记录一次OD值的时间间隔根据其反应速率而改变（以便得到最初直线段，一般为1s、5s、10s）。以最初直线的斜率（△OD/t）计算酶活力。一个酶活力单位定义为，在测定条件下，每分种引起吸光度改变0.001所需的酶量。测定仪器：紫外可见分光光度计（型号：U—1800）1.2.4? pH对PPO活性的影响???将缓冲液分别配制成醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.0、4.4、4.8、5.2、5.6），磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0），甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH8.8、9.2、9.6）。用不同pH的缓冲液分别提取粗酶液。按1.2.3方法分别测定不同pH下酶的活性。另外，以水提酶按上述方法在磷酸缓冲液中测定其活性。1.2.5??温度对PPO活性的影响???将底物和粗酶液分别在温度为0℃（由冰控制）、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃的恒温水浴内保温5min，然后迅速混合后。按1.2.3方法分别测定酶的活性1.2.6??底物浓度对PPO活性的影响???将底物浓度分别配制成0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.40mol/L。按1.2.3方法分别测定酶的活性。1.2.7??酶浓度对反应速率的影响????以粗酶液作为1，用pH7.6的磷酸缓冲液将粗酶液稀释成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8，再按1.2.3方法分别测定酶的活性。1.2.9??抑制剂、激活剂对酶活性的影响????用0.2mol/L pH7.6的磷酸缓冲液配制不同浓度的抗坏血酸、硫脲抑制剂、SDS激活剂。按1.2.3方法（加入的4mL缓冲液分别用不同浓度的抑制剂代替）测定酶的活性（抑制剂底物用0.4mol/L，激活剂底物用0.2mol/L）。1.2.10??(NH4)2SO4分离纯化PPO分别移取上述制备的PPO粗酶液10mL，向其中加入硫酸铵，使其饱和度分别达到0%、5%、15%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、85%、95%搅拌均匀，于0℃下静置12h?后，在5000r/min下离心15min，分离上清液并测定上清液中PPO活性和蛋白质含量，蛋白质含量用考马斯蓝法(在比色皿的厚度为0.5cm)?[4]。?2?结果与讨论2.1