分子生物学大实验.pptVIP

原核型重组表达质粒的构建及外源基因的诱导表达生物技术的核心部分2004.10  基因工程技术原理 基因工程技术的应用 基因工程原理 基因工程技术  将外源基因（又称目的基因，是一段 DNA 片断）组合到载体 DNA 分子中去，再把它转到受体细胞（亦称寄主细胞）中去，使外源基因在寄主细胞中增值和表达，从而得到期望的由这个外源基因所编码的蛋白质。 所以，基因工程的操作包含以下步骤： ? 获得目的基因 ? 构造重组 DNA 分子 ? 转化或转染 ? 表达 ? 蛋白质产物的分离纯化  到哪里去找目的基因？一般来说，人的基因，要从人体的组织细胞中去找；小鼠的基因要从小鼠的组织细胞中去找。????? 逆向转录???????????????? ????? 从染色体DNA中分离 人工合成 （2）目的基因的扩增 （3）PCR —— 把寻找目的基因和扩增目的基因两步操作并成一步。  PCR 的三个步骤为一次循环，约需3－5分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过 20 次循环，即可扩增 106 倍，经过 30 次循环，即可扩增 109 倍，时间仅需要2-3小时。 。 （4）构造重组 DNA 分子  其次要把目的基因“装”到载体中去。“安装”的过程，需要好几种工具酶，其中关键的酶叫 限制性内切酶 此酶识别一定碱基序列，有的还可切出“粘性”末端，使得目的基因和载体的连接非常容易。 （5）转化/转染—表达—蛋白质分离  重组 DNA 分子进入寄主细胞后，其中的目的基因能否表达，表达效率高低，还有很大差别。表达通常是指目的基因编码的蛋白质合成。基因工程的最后一步，是把所获得的蛋白质分离纯化，得到蛋白质产品。 二、基因工程的应用 基因工程的应用 （2）用于提高奶酪产量 生产奶酪的凝乳酶传统上来自哺乳小牛的胃。现在可以通过基因工程办法，用酵母生产凝乳酶，大量用于奶酪制造。 （3）转基因动物和植物 转基因动物首先在小鼠获得成功。现在转基因动物技术已用于牛、羊，使得从 牛/羊 奶中可以生产蛋白质药物。称为“乳腺反应器”工程。 转基因植物亦已在大田中广为播种。 ?（4）工程菌在环境工程中应用 美国 GE 公司构造成功具有巨大烃类分解能力的工程菌，并获专利，用于清除石油污染。 三、目的要求 1 熟悉基因工程基本原理、技术路线。 2 掌握：目的基因的PCR扩增技术、质粒DNA的提取纯 化技术、限制性内切酶酶切技术、核酸分子定量、 DNA分子体外连接、大肠杆菌感受态细胞的制备及转 化、重组子的筛选鉴定、外源基因的诱导表达、表 达产物的SDS检测等分子生物学中最常用的基 本实验技术。 3 培养同学们精确的实验操作技术，良好的实验 习惯和心理素质。 实验技术路线 pMAL-c2X 质粒简介 原核表达载体pMAL-C2x（英国NEB公司产品）：用于一个外源基因的表达和产物的分离纯化全序列及其详细资料可登陆获取。 。 做好分子学实验应注意的有关问题 分子生物学是一门新兴学科，可以解决生物学中许多以前解决不了的问题。随着分子生物学的发展，其应用范围也越来越广，做基因工程实验的人也日益增多，但许多人在实验中经常犯这样那样的错误。这里，我们总结了一些常见的错误供同学们借鉴，尽量减少同样的错误，以免影响实验进程。 心理素质问题 个人的心理素质对做基因工程实验 影响很大，平常心态稳定、习惯良 好的人，实验的成功率高，反之效 率极低，或做不出预期的结果。 1．畏惧心理 分子生物学是一门年轻的学科，从开始创立到如今，才短短的40余年。由于它的应用十分广泛，所以发展特别快，已开始形成了一套完整而成熟的基础理论和实验体系。分子生物学涉及的知识领域广泛，许多学科的新进展都很快与它联系起来，故它具有一定的神秘性，所以还没有进分子生物学这个门的人，都有一些畏惧心理。实际上分子生物学的基础理论本身还是比较简明具体，同时它的实验操作也都有专门的书籍详细介绍(如《分子克隆》)，读上几本基础书，再到有经验的实验室去实践，在较短的时间内是可以入门的。 2、轻视心理 有些已具有部分分子生物学知识的人，从各个公司的产品介绍书、专业文献中看到，很多实验的实验步骤经过前人的不断改进，变得十分的简便，有些大的实验在几天内即可完成，便认为基因工程实验简单，产生轻视心理，这种心理同样也是有害的。因