猪肝组织中核酸的提取及其成分鉴定.pptVIP

【实验目的】 生物大分子的分离提取原则 生物大分子的分离提取原则 分离纯化的基本步骤 分离纯化蛋白质的总原则 离心机和离心法 离心力的计算 离心机种类及用途 3、超速离心机 亚细胞结构的分离 【实验原理和操作】 磷酸鉴定 嘌呤碱鉴定 核糖鉴定 脱氧核糖鉴定 开始做实验！ * 猪肝组织中核酸的提取及其成分鉴定 生物化学实验 CQMU 添教材 生物化学与分子生物学实验室 2008.09 2、了解本实验设计思路。 1、学习离心技术，掌握 离心机的正确使用。 生物大分子分离提取原则是以生物大分子的理化性质（分子大小、形状、溶解度、带电性质等）为依据，周密设计分离提取流程图，将目的分子与其他分子分离提纯的过程。 生物大分子的分离提取工作是一件十分细致的工作，可谓系统工程，既要设法得到目的分子的纯品,又要努力保持其生物学活性，还要得率高。 生物大分子的基本制备技术 生物大分子的制备过程包括： 选材、 细胞破碎和细胞器分离、 生物大分子的分离提取、 样品纯化、 样品浓缩干燥和储存等方面。 1、取材 2、组织细胞破碎 3、提取 4、分离纯化 5、结晶 6、分析鉴定 、选择目的蛋白含量较高的材料； 、弄清欲纯化的蛋白质在各种试剂和拟采用 的条件下稳定性如何； 、探索和应用有效的抽提和粗提纯方法； 、建立一套层析方法进行细提纯； 、用较好的方法保存提取物； 、提取蛋白质的纯度鉴定。 离心技术 离心机根据应用目的分为制备和分析两种用途。 制备用离心机是应用最广泛的离心机，根据其性能可分为低速离心机、高速离心机和超速离心机。 一种通过使样品绕离心转轴的中心旋转而在其上产生一个远大于地球重力的仪器。 不同大小、不同形状、不同密度的颗粒在同一离心力场内会以不同的速度沉降而分离。 颗粒的沉降速度取决于离心机的转速和颗粒与中心轴的距离。 离心机的加速度通常用重力加速度(g=9.80m.s-2 )的倍数表示,被称为相对离心力(RCF或g值)。 RCF取决于转子的转数(n,以每分钟转数计,r/min)和旋转半径(r，以mm计): n 2 RCF = 1.118 r 1000 RCF在离心管内不相同，靠转子外最大,靠中心轴最小，有表可查。 1、低速离心机 常规使用,台式,最大速度3 000~6 000r/min, RCF可达6 000g。常用于收集细胞、细胞核或叶绿体等较大的细胞器、抗原-抗体复合物等粗颗粒沉淀。 2、高速离心机 较大立式，常有制冷系统。最高速率可达25 000r/min、RCF达60 000g。用于分离微生物细胞、线粒体、溶酶体等细胞器和蛋白质沉淀物。 一类速度非常高的离心机，最大转速可超过30 000r/min，最大RCF可达600 000g，用于沉淀核糖体、膜泡等小的细胞器和生物大分子。具有精密的制冷、真空装置。 4、微量离心机 台式,能迅速加速到12 000r/min,10 000g 用于短时间(0.5 ~1.5min)对大颗粒沉淀、小 体积溶液(小于1.5ml)的沉降，尤其用于从液 体培养基中快速分离细胞。 100g 5min 真核细胞 4 000g 10min 叶绿体 细胞碎片 细胞核 15 000g 20min 细菌、线粒体 30 000g 30min 溶酶体、细菌细胞碎片 100 000g 3~10h 核糖体 生物颗粒在离心场中所需离心加速度和时间 离心加速度 时间 沉降的组分 实验步骤 猪肝匀浆制备 分离提取核酸 离心 水解核酸 鉴定 1.制备肝匀浆 猪肝 + 生理盐水 肝匀浆 匀浆器 【实验原理和操作】 2.分离提取核酸 肝匀浆倒入刻度离心管(4ml) 加2%三氯醋酸4ml,搅匀 静置3min，3000转离心5min 倾去上清液，沉淀中加95%乙醇4ml，搅匀 沸水中加热至沸2min 取出冷却后离心（3000转/分，5min） 取出冷却后离心 倾去上清液，离心管倒置于滤纸上倒干乙醇 加10%NaCl溶液4m