DNA提取和常见问题分析及对策.docVIP

DNA提取和常见问题 分析及对策 主讲人： 关锰  DNA简单介绍 DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象。 为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高 分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。  DNA提取原则 ? 保证DNA结构的完整性 ? 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 ? 排除有机溶剂和金属离子的污染 ? 蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度 ? 排除其他核酸分子的污染  DNA提取的几种方法 一、染色体DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它  DNA提取的几种方法 二、非染色体DNA的提取 质粒DNA的提取 ? 碱裂解法 ? 煮沸法  线粒体、叶绿体DNA的提取 ? 差速离心结合SDS裂解法  CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基 三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜， 并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通 过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙 醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷 的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。  CTAB法流程图 植物材料 裂解液 异丙醇沉淀  液氮研磨 抽提 离心洗涤 DNA溶液  细胞裂解 上层溶液 干燥溶解  CTAB中各个组分的作用 CTAB提取缓冲液的经典配方 ? Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ? EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性； ? NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； ? CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； ? β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使 酚容易去除。  CTAB提取缓冲液的改进配方 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚 形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少 DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效 去除多糖。  除蛋白质： ? 氯仿/异戊醇抽提(氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机 相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程 中出现的气泡）。 ? 使用变性剂变性 (SDS.异硫氰酸胍等） ? 高盐洗涤 ? 蛋白酶处理  除多糖： ? 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积 的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 ? 用多糖水解酶将多糖降解。 ? 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以 与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。  除酚类物质： ? 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基 乙醇.抗坏血酸.半胱氨酸.二硫苏糖醇等 ? 加入易与酚类结合的试剂：如PVP.PEG(聚乙二 醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类 与DNA的结合  除盐离子： 70％的乙醇洗涤  TE中成分的作用 ? TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase ? pH值为8.0，可防止DNA发生酸解  称取样品，液氮研磨，加入预热的(65℃ ) CTAB及β-巯基乙醇 保温1h,期间不停的摇均 吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒 混匀,10000rpm,10min 取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀, 10000rpm,10min 取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4 ℃ /-20 ℃保温沉淀 10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干 用TE溶解DNA,然后低温保存  应注意的问题 材料准备： 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融。 液氮研磨： 研磨样品时要有液氮的保护，在整个过程中都不要让液氮 挥发干净。避免材料回温和反复冻融带来的降解。此外尽 量将样品研磨的很细，这样可以提高DNA产量。 细胞裂解： 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。 高温温浴时，定时轻柔振荡。  应注意的问题 DNA沉淀：用乙醇或异丙醇都可以。异丙醇沉淀的效率要高于无水乙 醇，试验中只需要0.6倍体积的异丙醇沉淀；而需要2倍体 积的无水乙醇。但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀， 且在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去 。 DNA干燥：晾干DNA，让乙醇充分挥发。 DNA溶解：若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。  基因组DNA的检测 ? 高质量的基因组DNA带型 单一无拖尾现象 ? DNA浓度及纯度的检测 A260=1 约 50 μg/ mL ?