博士后论文--人溶菌酶转基因山羊乳腺生物反应器的研制.pdfVIP

华东师范大学 博士后学位论文 人溶菌酶转基因山羊乳腺生物反应器的研制 姓名：刘思国 申请学位级别：博士后 专业：动物学 指导教师：成国祥;钱旻 撼要 本研究为获得乳汁中高效表达人溶菌酶(bLYz)的转蕊因山羊，分涮以人 的“一乳清白蛋白、山羊B～酪蛋囱、牛as卜酪髓白和牛B一乳球蛋白基因为调控 姨分蕊趣好熬G4{8捩缝亮壅中黪选凄了整台蠢这些秘彳孛戆攀霓鏊缎笼。苏转基 因祭合的细胞株为供核细胞，进行山羊体细胞毙隆。共计投入489头山羊，最终 3 获得了22只成活的觅隆山羊，分别为pAAlyzc4只、pBclyzc4只、pINSlyz 冀、p毵1yzg5灵、p3晦lyz6只。熬合签定表骥，p矗矗lyze豹《只凼羊帮pl憋lyz 3只山羊均不携带外源基因，其他克隆山羊均包含有预期的外源基因。通过人工 诱导泌乳的乳中hLYz表达分析表明：整合有pBLGlyz基因的克隆山羊在乳汁中 高效表达了久溶菡酶，英中B臻l秘g弱2熬表达水平分裂为39屈穗49屈。蜜然 泌乳后，乳汁中仍然可维持人溶荫酶的高效表遮。经sP—Serphrose离子交换层 析和超滤楣结台纯化了转基因山羊乳汁中的人浓菌酶，纯度达98％以上。溶壁微 球菌溶熊实验测定该溶菌酶豹魄添与天然太懿溶菌酶潘经穗警，为l，《一1．6× 10。Iu／mg。重组人溶黼酶的性质撩定表明：卅端10个氨基酸测序与天然人的溶 茸酶完全～致；具有很好的热稳定性和洲稳定性；具有广谗嬲革兰氏阳性菌抗 菌活豫，jmg麻l时对溯定的40裸临床分离菌静搠翻率均在9隔以上。 阱上结果表明：该研究首次获得了乳汁中可表达克级水平的人溶菌酶转基 因山羊；重组入溶菌憋能够在转基因山羊乳腺中避彳亍持续、赢效的表达且不对受 体由羊的生理功能产生不良影响。转基因山羊乳躲中表达酶人溶菌酶具有阏天然 入乳溶麓酶相近的理化性质和生物学活性，可傲大规模商业化开发。同时也表明 蒋缀熬体铃遗筵掺镑缝会核移植投术是赢效刳餐转基因家畜豹方法，可用隧援量 生产转熬因家畜。 月U 茜 afIloy卜hydr。1ase)， 或肽聚糖N一乙酰基胞壁酰水解酶(peptidoglycanN—acetylmur 性免疫作用。LYz能切断革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖中N一乙酰胞壁酸(NAM)和N一 乙酰葡萄糖胺(NAG)之间的B一1，4一糖苷键，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的 作用下使细胞胀裂，从而引起细菌裂解。它对少数革兰氏阴性菌以及一些含几丁质 细胞壁的真菌也有一定的破坏作用。LYZ是一种碱性蛋白质，在体内近于中性的pI{ 环境下带有大量正电荷，可与带负电荷的病毒蛋白起作用，和DNA，RNA、脱辅基蛋 白形成复盐，使侵入体内的病毒失活。 LYz在食品工业上可用作防腐剂、保健品等。在医学临床上可作为消炎药，用 于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、带状疱疹感染和扁平疣等，也可与其它抗 菌药物合用治疗各种细菌感染。应用市场前景广阔。 LYz广泛存在于人和动物的各种组织、体液以及某些植物和微生物中。目前主 要从鸡蛋清中提取用于临床。但由于鸡蛋清溶菌酶(HenEggwhite 是一种异源蛋白，在人体内会产生免疫原和副作用。因此，HEwL的应用受到一定的 限制。与其他来源LYz相比，人溶菌酶(HumanLysozyIlle，hLYz)有许多优点。首 先，hLYZ是人内源性蛋白质，与人体具有天然的相容性，不会对人体产生不良反应 和副作用。其次，hLYZ活性高，是HElvL的3倍。 天然hLYz可从乳汁、尿液、中性粒细胞或胎盘中少量提取。但从天然材料中 提取hLYz时，来源极其稀少，无法进行工业化生产；而且所用生物材料来自不同 人群或个体，难以保证不受病毒或其他有害物质的污染，安全性得不到保障，产品 质量的稳定性也难以保证。rhLYz已经在大肠杆菌、酵母菌、霉菌