细胞组织培养技术.pptVIP

细胞组织培养技术 概 况 从机体中取出组织或细胞，模拟机体内的生理条件在体外进行培养，使之生存和生长，称之为组织培养。组织培养技术在流感病毒研究及监测等方面的应用已越来越引起人们的重视。因近来发现，用组织培养细胞所分离到的流感病毒，其抗原性和基因特性要比用鸡胚分离到的更接近原始采集的标本，故世界卫生组织号召大家寻找合适的细胞来制备流感病毒疫苗，来替代鸡胚制备疫苗。最近我国发现，“O”相流感病毒株在人群中消失30余年后，又重新出现，同时还发现用组织培养细胞来分离“O”相毒株要比鸡胚系统敏感的多。 用于流感病毒研究的细胞 原代细胞:如人胚肾细胞、猴肾细胞、鸡胚肾；双倍体细胞 传代细胞：如非洲绿猴肾细胞（Vero cells）、狗肾传代细胞（MDCK）、牛肾传代细胞（MDBK） 细胞培养的主要优点 可提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，比较经济，方便 可消除其他外界因素的影响，对疫苗生产来说其抗原性更接近于自然流行株 可减少宿主蛋白成分，减少变态反应 组织培养的主要缺点 病毒复制后滴度低，不易保存，保存时易使病毒滴度丢失 传代细胞含致癌因子，通过传代细胞所获得的病毒不宜用于疫苗生产 随细胞代数增加，对病毒敏感性下降 细胞培养的基本条件 接种细胞量 培养液 氢离子浓度及气体条件 温度 无菌条件和培养器皿的清洁度 细胞接种数 一般来讲，细胞量越大繁殖的速度越快，但太大的细胞量对于生长亦不利。传代细胞一般为10—30万/ml，细胞一般可在3—7天长成单层 合成培养液 以前多用天然培养液，现在多用合成培养液。合成培养液有多种，如Eagle氏液、1640、199、DMEM等，其主要成分为氨基酸、糖、维生素、无机盐及其他成分。 合成培养液中不含蛋白质成分，血清蛋白对组织培养是不可缺少的，不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁。不同血清对细胞促进作用不同。以胎牛血清最好，小牛血清次之。 酸碱度 细胞生长最宜的PH范围是7.0—7.4。细胞可忍受较大的范围PH变化（PH6.6—7.8）培养环境偏酸较偏碱更宜于细胞贴壁。培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐、磷酸氢盐和血清。其中碳酸氢盐/CO2为主要的缓冲体系，如使用CO2孵箱，能提供稳定的5%CO2，可自动调节细胞代谢引起的PH改变。 另外，在培养液中加入氢离子缓冲剂，如HEPES可使培养液有较强的缓冲能力。 温 度 细胞培养的最适温度与细胞来源的动物体温一致，温度增加2—3℃对细胞产生不良影响，低温对细胞影响较小 无菌条件 培养器皿的处理 常用的主要器皿：玻璃、塑料 玻璃器皿一般须用清洁液浸泡，清水洗10次后再用蒸馏水洗2次，烤干备用 单细胞的制备 贴壁生长的传代细胞使之分散成单细胞的方法有 酶消化法 螯和剂分散法 酶消化法 胰蛋白酶能消化细胞间的蛋白质成分，组织块受它作用后细胞变为圆形，再用吸管机械吹打或电动搅拌细胞可分散 胰蛋白酶用的浓度过大或时间过长对细胞均有损伤，影响细胞的生长。因此，不同组织来源、不同年龄的动物组织所用酶的浓度和时间可以不同。 通常用0.25%-0.5%的酶。 组织培养的材料 1．生长成片的MDCK细胞 2．T-75细胞培养瓶, 颈口有倾角。 3．D-MEM培养液 4．青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素 G；10,000 μg/ml 硫酸链霉素) ，分装后保存于-20 ℃。 5．HEPES 缓冲液, 1 M 母液。 6．胎牛血清，40 nm滤过。 7．EDTA-胰酶 (0.05% 胰酶；0.53 mM EDTA . 4Na)，分装后保存于-20 ℃ 8．牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液。 9．1ml 、10ml无菌移液管 10．70％～75％的酒精 组织培养的步骤 准备细胞生长液 清洗细胞 消化细胞 加入生长液，混匀，分装细胞瓶 MDCK细胞生长液的准备 含L-谷氨酸的完全型D-MEM培养液的准备（用于MDCK培养）： 500 ml D-MEM液中加入： 青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 μg/ml 链霉素) HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM) 7.5%牛血清白蛋白组分V 12.5 ml 细胞生长液 胎牛血清5 ml 加到 95 ml 的完全型D-MEM液使胎牛血清的终浓度为5%。 注：此处采用进口特级胎牛血清