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微生物发酵工程实验 何琳燕 2010-11 实验内容 实验一 机械搅拌发酵系统结构与控制系统 实验二 中试搅拌发酵罐的使用与维护 实验三 培养基的分批灭菌 实验四 磷细菌高密度发酵 实验五 喷雾干燥 时间安排 11月8、9、12日下午，熟悉发酵罐系统。 11月22日周一，单因子实验，优化磷细菌发酵培养基的碳源。 优化磷细菌发酵培养基的碳源（单因子实验） 菌种：无机磷细菌 培养基 发酵培养基A：可溶性淀粉0.6%，硫酸铵0.5%，硫酸镁0.06%，磷酸氢二钾0.1%，酵母粉0.05%，pH 7.0-7.5 发酵培养基B：葡萄糖0.2%，可溶性淀粉0.4%，硫酸铵0.5%，硫酸镁0.06%，磷酸氢二钾0.1%，酵母粉0.05%，pH 7.0-7.5 发酵培养基C：葡萄糖1%，硫酸铵0.5%，硫酸镁0.06%，磷酸氢二钾0.1%，酵母粉0.05%，pH 7.0-7.5 发酵培养基D：葡萄糖1%，玉米粉0.6%，硫酸镁0.06%，磷酸氢二钾0.1%，酵母粉0.05%，pH 7.0-7.5 无机磷培养基：葡萄糖1%， (NH4 ) 2 SO4 0.5%，NaCl 0.03%，KCl 0.03%，FeSO4·7H2O 0.003%，MnSO4·4H2O 0.003%，Ca3 ( PO4 ) 2 1%，琼脂2%，pH 7.0-7.5 实验步骤 配制培养基，分装于150或250 mL三角瓶，包扎后，115 ℃灭菌20 min。发酵培养基A/B/C/D各3瓶。 接种，接种量1%。 培养，28 ℃、150 rpm培养18-24 h. 测定细胞数量，取发酵液1 mL系列稀释，取0.1 mL菌液涂布无机磷培养基， 28 ℃恒温培养3 d后计数。 11月23日周二下午， 单因子实验，优化磷细菌发酵培养基的碳源。（完成系列稀释、涂布，发酵液还原糖测定） 发酵罐开盖，清洗。 磷细菌种子制备 11月24日周三上午，发酵系统启动，pH电极标定，溶氧电极标定，发酵培养基配制、装罐。 周三下午，培养基分批灭菌。灭菌培养基取样、无菌检查。 周三晚上，种子无杂菌检查。接种，上罐，发酵控制，接种后取样测定（细菌数量、pH、还原糖等）。 周三晚上，夜班，关注发酵控制参数， 11月25日周四上午，取样测定（细菌数量、pH、还原糖、杂菌率等） 周四下午，取样测定（细菌数量、pH、还原糖、杂菌率等） 11月26日周五上午，放罐，清洗发酵罐；计数摇瓶实验结果 周五下午，喷雾干燥。 磷细菌高密度发酵 菌种：无机磷细菌 培养基 种子培养基见讲义第7页 发酵培养基A 无机磷培养基见讲义第7页 LB培养基见讲义第7页 种子制备 配制种子培养基，分装100mL/500mL三角瓶，包扎，115℃灭菌20min，接种，28℃、150rpm培养18-24h 问题：用于接种发酵罐，接种量5%，请问7L培养基需要多少菌种用量？ 种子接入发酵罐 种子质量检查（包括哪些项目？分别用什么方法？） 接种前还需要做什么？ 火圈接种法 接种后需要做什么？ 发酵控制 pH 泡沫 菌体浓度和形态 还原糖 发酵终点 灭菌培养基无菌度测定 （1）显微镜观察法 利用刚果红染色法可以在显微镜下快速区别死活菌。 原理：活菌具有排斥染液的能力，而死菌失去了排斥染液的能力，因此，无色透明的是活菌，死菌为蓝色或浅蓝色。 方法：将待测稀释液与一滴刚果红染色液很薄的均匀涂在载玻片上，风干后滴盐酸1-2滴，涂片变蓝，风干后在高倍镜或油镜下观察。 刚果红溶液：称取刚果红0.1-0.2 g，溶于10 mL水中。 盐酸酒精溶液：95%酒精1-2 mL，蒸馏水10 mL，再加入浓盐酸0.25-0.3 mL混合即成。 （2）平板培养法 可取出少量灭过菌的培养基置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，若无菌生长，即视为灭菌彻底。 * 磷细菌高密度发酵 摇瓶试验——培养基优化（单因子试验） 发酵——发酵罐培养 发酵参数调试稳定，如温度控制系统，空气流速，罐压，pH等。 培养基灭菌质量检查