白斯古楞论文答辩.ppt

抗癌活性肽对大肠癌LOVO细胞及相关凋亡基因的影响 学 科 专 业：外科学 导 师 姓 名：王茂春 教授 指 导 教 师: 苏秀兰 教授 研 究 生 姓 名：白斯古楞 前言 大肠癌为人类常见的恶性肿瘤之一，病死率极高。在我国的发病率有大幅度提高，病死率也不断上升，已经位居恶性肿瘤死亡率的第4～5位[3,4] 。目前大肠癌的治疗还是以手术治疗为主，但即使结直肠癌病人接受了根治性手术，复发率仍较高，而再次手术的机会又很小[5]。大肠癌的高发病率与相对低存活率表明对其需要一种更有效的治疗策略，需要积极探索大肠癌生物治疗的新方法，以提高患者的生存质量，延长生命，为全身治疗创造条件。 抗癌活性肽（Anticancer bioactive peptide，ACBP 是一种天然活性物质,相对分子质量小于800kd，属于小分子多肽[13,14,15] 。具有抑制肿瘤细胞增殖和激活免疫系统的双重作用，大量体外细胞实验和动物体内试验证明，ACBP能够抑制胃癌，卵巢癌，鼻咽癌，胆囊癌等多种肿瘤细胞的DNA合成，诱导肿瘤细胞凋亡和分化，降低肿瘤患者血液粘稠度，改善微循环，调节患癌机体无氧糖酵解，提高机体免疫力。 P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高，研究最广泛、深入的基因之一。p53分为野生型 wild-type p53,wtp53 和突变型 mutant-type p53,mtp53）[7] 。野生型p53 对细胞的分裂和增殖起负调控作用，是抑癌基因。而p53蛋白由于不稳定，易发生突变，一旦p53发生突变，就会丧失野生型p53 基因所具有的细胞周期停滞、诱导凋亡发生、介导细胞衰老、维持基因稳定和错配基因修饰等抑癌功能，同时获得许多癌基因的特殊功能。 Bcl-2基因家族分为两大类：一类是抗凋亡蛋白，另一类是促凋亡蛋白[8]。bcl-2、Bcl-xl属于Bcl-2基因家族成员中抗凋亡蛋白一类。bcl-2基因能抑制细胞凋亡而延长细胞的寿命，但不能促进细胞增殖，即细胞凋亡抑制基因。 Bcl-xl基因是近几年发现的Bcl-2家族成员的代表，为抑制凋亡的蛋白，在人体各组织中均有表达[11]。 Bcl-xl功能与bcl-2相似，能与Bak蛋白一起形成异二聚体，来中和Bak蛋白的促凋亡作用，从而抑制细胞的凋亡。 研究目的 探讨抗癌活性肽（ACBP）对大肠癌细胞株的凋亡和p53、bcl-2、Bcl-xl基因表达的影响，进一步完善抗癌活性肽对大肠癌细胞的抑制作用机制，证实其对大肠癌细胞有生长抑制的作用。 实验路线图 实验方法 体外培养人体大肠癌lovo细胞株 实验分组：将大肠癌lovo细胞株常规复苏,放入在37℃、5% CO2,饱和湿度的培养箱中培养。24小时更换DMEM培养基一次,待细胞融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代,取3-4代的细胞，分别加入生理盐水 0.5mL，对照组 、5-FU 0.5mL，阴性对照组 、抗癌活性肽 0.5mL，用药组 用药24h后倒置显微镜下观察各组lovo细胞形态学改变。 收集细胞加入1ml的Trizol 提取总RNA 细胞总RNA鉴定：1％的琼脂糖电泳来鉴定细胞总RNA，观察出现的各个条带及条带亮度。 总RNA提取步骤： DU800紫外分光光度计测定：分别测定细胞的总RNA光密度值 OD 在260nm和280nm处的,并计算RNA的含量和纯度。要求RNAOD260/OD280值在1.5-2.0之间，浓度在500ug/ml以上的符合实验条件。 RT-PCR半定量方法检测抗癌活性肽（ACBP）对大肠癌lovo细胞p53、bcl-2、Bcl-xl基因表达的影响。 RT反应液配置 试剂 使用量 5×PrimeScript?Buffer 4 μl PrimeScript?RT Enzyme Mix I 1 μl Oligo dT Primer（50 μM） 1 μl Total RNA 根据浓度计算体积RNase Free dH2O up to 20 μl 注：Total RNA用量为1ug 。 反转录反应条件如下: 37℃ 15 min *3（反转录反应） 85℃ 5 sec（反转录酶的失活反应） PCR反应液配制（15ul） 试剂 使用量 5×PrimeSTAR?Buffer（Mg2+ plus）