荧光定量PCR检测白纹伊蚊羽化后不同时期成蚊体内漆酶型酚氧化酶转录水平的变化.docVIP

  荧光定量 PCR 检测白纹伊蚊羽化后不同时 期成蚊体内漆酶型酚氧化酶转录水平的变 化#  5 10 15 20 25 30  吴贤生，吴瑜，郑小英，何蔼，甘明，詹希美** （中山大学中山医学院，广州 510000） 摘要：漆酶是一种结合有三个铜离子的蓝色多铜蛋白酶，可以氧化一系列酚类化合物。在昆 虫的生命过程中，漆酶可能在表皮形成、鞣化过程中起着关键作用。白纹伊蚊漆酶型酚氧化 酶（Aedes albopictus Laccase）最早由刘静等克隆获得，但未对该基因的型别进行鉴定。 本研究对该基因进行了分类鉴别，确定该基因归属于 2 型漆酶型酚氧化酶并命名为 AaLac2。 通过构建 AaLac2-Pet30a 重组质粒，在 E.coli BL21（DE3）中表达了 AaLac2 蛋白，并将重 组蛋白和使用胰蛋白酶从白纹伊蚊组织中提取的蛋白进行比较，二者在聚丙烯酰胺凝胶电泳 中表观分子量相近，均略大于预计分子量，重组蛋白以包涵体的形式表达。收集羽化后不同 时期的白纹伊蚊雌雄成蚊，通过 Quantitative RT-PCR 检测成蚊体内 AaLac2 的转录水平， 发现 AaLac2 在白纹伊蚊羽化初期处于一个较高水平并随着羽化完成迅速降低。我们的研究， 为深入研究 AaLac2 的生理功能提供了基础。 关键词：白纹伊蚊；漆酶型酚氧化酶；蛋白表达；表达荧光定量。 中图分类号：Q78 Quantitative RT-PCR Analysis of Aedes albopictus Laccase2 expression after molting Wu Xiansheng, Wu Yu, Zheng Xiaoying, He Ai, Gan Ming, Zhan Ximei (Zhongshan School of medicine, Sun Yet-sen University, Guangzhou 510000) Abstract: Laccase (EC ) is a member of a group of protein that known as mulitcopper oxidases which contains tree coppers and with p-dephenol activity. And laccase2 may have a key role in insect culticle sclerotization. Aedes albopictus laccase2 was found by liu, but she didn’t classify it to laccase1 or laccase2. We cloned, classified and named this gene Aedes albopictus Laccase2. The recombinant protein of His-AaLac2 was expressed in E. coli BL21 (DE3), We also extracted AaLac2 from Aedes albopictus culticle using trypsin. The molecular weight of the recombinant protein was larger than that predicted. We collected different periods of Aedes albopictus after molting, and detected the level of expression of AaLac2 through quantitative Rt-PCR. AaLac2 shown strong expression at the beginning and soon decrease to a low level after molting. Key words: Aedes albopictus; Laccase2； recombinant protein; Quantitative RT-PCR. 35 0 引言 漆酶最早是有日本人 Yodashi[1]于 1883 年在日本漆树（Rhus vernicifera）的树液中发现 的，随后，人们从担子菌类和子囊菌类真菌以及某些昆虫体内发现了漆酶的存在[2]，Antorini 40 在 2002 年首次获得了具有活性的完整真菌漆酶结构晶型[3]。真菌漆酶具有较强的非特异性 基金项目：新教师基金（200805581108）；国家自然科学基金 作者简介：吴贤生（1987-11-12），男，硕士研究生，医学昆虫